Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het KU Leuven Research Fund en het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) - Vlaanderen. E.L. (11A3320N) en C.N. (1S14218N) worden ondersteund door een Ph.D. Fellowship van het FWO/FWO-SB.

Dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door de Ethische Commissie dierproeven KU Leuven (P153/2018). Alle muizen werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van de universiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden (constante temperatuur van 23 ± 1,5 ° C, relatieve vochtigheid 40% -60% en een dag / nachtcyclus van 12 uur), met toegang tot water en voedsel ad libitum.
1. Muizen
<ol><li>Gebruik in de handel verkrijgbare muizenstammen, zoals C57BL/6J-muizen, ...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

De al-afgeleide organoïden, zoals hier beschreven, vertegenwoordigen een krachtig onderzoeksmodel om hypofysestamcellen in vitro te bestuderen. Op dit moment is deze organoïde benadering het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen te laten groeien en uit te breiden. Eerder is een hypofyse-organoïdemodel afgeleid van embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gemeld, dat de hypofyse-embryonale organogenese nauw samenvat<sup ...

De hypofyse is een kleine endocriene klier aan de basis van de hersenen, waar het is verbonden met de hypothalamus. De klier integreert perifere en centrale (hypothalamische) inputs om een afgestemde en gecoördineerde hormoonafgifte te genereren, waardoor stroomafwaartse doel endocriene organen (zoals bijnieren en geslachtsklieren) worden gereguleerd voor het produceren van geschikte hormonen op het juiste moment. De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem en wordt daarom met recht de meesterklier1 genoemd.
De hypofyse van de muis bestaat uit drie lobben (figuur 1), d.w.z. de voorkwab (AL), de tussenkwab (IL) en de achterkwab (PL). De belangrijkste endocriene AL bevat vijf hormonale celtypen, waaronder somatotropen die groeihormoon (GH) produceren; lactotropen die prolactine (PRL) genereren; corticotropen die adrenocorticotroop hormoon (ACTH) afscheiden; thyrotropen die verantwoordelijk zijn voor de productie van schildklierstimulerend hormoon (TSH); en gonadotrofen die luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) maken. De PL bestaat uit axonale projecties van de hypothalamus waarin de hormonen oxytocine en vasopressine (antidiuretisch hormoon) zijn opgeslagen. De IL bevindt zich tussen de AL en PL en herbergt melanotropen die melanocytstimulerend hormoon (MSH) produceren. In de menselijke hypofyse gaat de IL achteruit tijdens de ontwikkeling en worden melanotropen verspreid binnen de AL1. Naast de endocriene cellen bevat de hypofyse ook een pool van stamcellen, in wezen gekenmerkt door de transcriptiefactor SOX2 2,3,4,5,6. Deze SOX2+-cellen bevinden zich in de marginale zone (MZ), de epitheelbekleding van de spleet (een embryonaal restlumen tussen de AL en IL), of zijn als clusters verspreid over het parenchym van de AL, waardoor twee stamcelniches in de klier worden voorgesteld (figuur 1)2,3,4,5,6.
Gezien de onmisbare aard van de hypofyse, wordt slecht functioneren van de klier geassocieerd met ernstige morbiditeit. Hyperpituïtarisme (gekenmerkt door oversecretie van een of meer hormonen) en hypopituïtarisme (defecte of ontbrekende productie van een of meer hormonen) kunnen worden veroorzaakt door hypofyse neuro-endocriene tumoren (PitNETs; bijv. ACTH-producerende tumoren die leiden tot de ziekte van Cushing) of door genetische defecten (bijv. GH-deficiëntie resulterend in dwerggroei)7. Daarnaast zijn hypofysechirurgie (bijvoorbeeld om tumoren te verwijderen), infecties (bijv. Hypothalamus-hypofysetuberculose of infecties na bacteriële meningitis of encefalitis), het syndroom van Sheehan (necrose vanwege onvoldoende bloedstroom als gevolg van zwaar bloedverlies bij de geboorte), hypofyse-apoplexie en traumatisch hersenletsel andere belangrijke oorzaken van hypofysehypofunctie8 . Het is aangetoond dat de hypofyse van de muis het regeneratieve vermogen bezit en in staat is om lokale schade te herstellen die wordt geïntroduceerd door transgene ablatie van endocriene cellen 9,10. De SOX2+ stamcellen reageren acuut op de toegebrachte verwonding met een geactiveerd fenotype, gekenmerkt door verhoogde proliferatie (resulterend in stamcelexpansie) en verhoogde expressie van stamgerelateerde factoren en routes (bijv. WNT / NOTCH). Bovendien beginnen de stamcellen het geableerde hormoon tot expressie te brengen, wat uiteindelijk resulteert in een aanzienlijk herstel van de uitgeputte celpopulatie gedurende de volgende (5 tot 6) maanden 9,10. Ook tijdens de neonatale rijpingsfase van de klier (de eerste 3 weken na de geboorte) gedijen de hypofysestamcellen in een geactiveerde toestand 6,11,12,13, terwijl organismale veroudering geassocieerd is met verminderde in situ stamcelfunctionaliteit, als gevolg van een toenemende inflammatoire (micro-) omgeving bij veroudering (of 'ontsteken')10,14 . Bovendien is tumorigenese in de klier ook geassocieerd met stamcelactivering 7,15. Hoewel stamcelactivering is gedetecteerd in verschillende situaties van hypofyseremodellering (beoordeeld in 7,16), blijven de onderliggende mechanismen onduidelijk. Aangezien in vivo benaderingen (zoals het traceren van afstamming bij transgene muizen) geen duidelijk of volledig beeld van hypofysestamcellen hebben opgeleverd, is de ontwikkeling van betrouwbare in vitro modellen om stamcelbiologie in normale en zieke hypofyse te onderzoeken essentieel. Standaard in vitro kweek van primaire hypofysestamcellen blijft ontoereikend vanwege de zeer beperkte groeicapaciteit en niet-fysiologische (2D) omstandigheden met snel verlies van fenotype (voor een meer gedetailleerd overzicht, zie16). 3D-bolculturen (pituisferen) zijn vastgesteld uit hypofysestamcellen zoals geïdentificeerd door zijpopulatie en SOX2+ fenotype 2,3,4. De pituisferen groeien klonaal uit de stamcellen, drukken stammarkers uit en vertonen differentiatievermogen in de endocriene celtypen. Ze breiden zich echter niet aanzienlijk uit terwijl ze slechts een beperkte doorgang vertonen (2-3 passages)3,4. Bolachtige structuren werden ook verkregen uit niet-gedissocieerde hypofyse stamcelclusters wanneer gekweekt in 50% verdund Matrigel gedurende 1 week, maar de uitbreidbaarheid werd niet aangetoond17. De pituisfeerbenadering wordt meestal gebruikt als uitleesmiddel voor stamcelaantallen, maar verdere toepassingen worden beperkt door inferieure expansiecapaciteit16.
Om deze tekortkomingen aan te pakken en te overwinnen, is onlangs een nieuw 3D-model vastgesteld, d.w.z. organoïden, uitgaande van de belangrijkste endocriene AL van muizen die de MZ en parenchymale stamcellen bevatten. Het is aangetoond dat de organoïden inderdaad zijn afgeleid van de stamcellen van de hypofyse en hun fenotype18 getrouw samenvatten. Bovendien zijn de organoïden op lange termijn uitbreidbaar, terwijl ze hun stengelachtigheid robuust behouden. Daarom bieden ze een betrouwbare methode om primaire hypofysestamcellen uit te breiden voor diepgaande verkenning. Een dergelijke exploratie is niet haalbaar met het beperkte aantal stamcellen dat uit een hypofyse kan worden geïsoleerd, die ook niet uitbreidbaar zijn in 2D-omstandigheden16. Het is aangetoond dat de organoïden waardevolle en betrouwbare hulpmiddelen zijn om nieuwe hypofysestamcelkenmerken te ontdekken (vertaalbaar naar in vivo)14,18. Belangrijk is dat het organoïde model de hypofysestamcelactiveringsstatus getrouw weerspiegelt als optredend tijdens lokale weefselbeschadiging en neonatale rijping, met verbeterde vormingsefficiëntie en replicerende upregulated moleculaire routes14,18. Vandaar dat het van hypofyse afgeleide organoïdemodel een innovatief en krachtig hypofysestamcelbiologisch onderzoeksmodel is, evenals een hulpmiddel voor het uitlezen van stamcelactivering.
Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van van hypofyse afgeleide organoïden van muizen. Om dit doel wordt de AL geïsoleerd en gedissocieerd in afzonderlijke cellen, die zijn ingebed in extracellulair matrix-nabootsend Matrigel (hierna ECM genoemd). De cel-ECM-assemblage wordt vervolgens gekweekt in een gedefinieerd medium, dat in wezen stamcelgroeifactoren en hypofyse-embryonale regulatoren bevat (verder aangeduid als 'hypofyseorganoïde medium' (PitOM)18; Tabel 1). Zodra de organoïden volledig zijn ontwikkeld (na 10-14 dagen), kunnen ze verder worden uitgebreid door sequentiële passaging en worden onderworpen aan uitgebreide downstream-exploratie (bijv. Immunofluorescentie, RT-qPCR en bulk- of eencellige transcriptomica; Figuur 1). Op de langere termijn wordt verwacht dat de hypofysestamcelorganoïden de weg vrijmaken voor weefselherstelbenaderingen en regeneratieve geneeskunde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

De hypofyse is de belangrijkste endocriene klier die belangrijke fysiologische processen reguleert, waaronder lichaamsgroei, metabolisme, seksuele rijping, voortplanting en stressrespons. Meer dan tien jaar geleden werden stamcellen geïdentificeerd in de hypofyse. Ondanks de toepassing van transgene in vivo benaderingen blijven hun fenotype, biologie en rol echter onduidelijk. Om dit raadsel aan te pakken, wordt een nieuw en innovatief organoïde in vitro model ontwikkeld om de hypofysestamcelbiologie diep te ontrafelen. Organoïden vertegenwoordigen 3D-celstructuren die, onder gedefinieerde kweekomstandigheden, zichzelf ontwikkelen uit de (epitheliale) stamcellen van een weefsel en meerdere kenmerken van die stamcellen en hun weefsel samenvatten. Hier wordt aangetoond dat van hypofyse afgeleide organoïden van muizen zich ontwikkelen uit de stamcellen van de klier en hun in vivo fenotypische en functionele kenmerken getrouw samenvatten. Ze reproduceren onder andere de activeringstoestand van de stamcellen als in vivo optredend als reactie op transgeen toegebrachte lokale schade. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar met behoud van hun stengelfenotype. Het nieuwe onderzoeksmodel is zeer waardevol om het fenotype en gedrag van de stamcellen te ontcijferen tijdens belangrijke omstandigheden van hypofyseremodellering, variërend van neonatale rijping tot verouderingsgerelateerde vervaging en van gezonde tot zieke klieren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om van hypofyse afgeleide organoïden van muizen vast te stellen, die een krachtig hulpmiddel bieden om in de nog raadselachtige wereld van hypofysestamcellen te duiken.

Na isolatie en dissociatie van de AL worden de verkregen enkelvoudige cellen in ECM gezaaid en in PitOM gekweekt (figuur 1, tabel 1). Figuur 3A toont de celcultuur en dichtheid bij het zaaien (dag 0). Er kan wat klein puin aanwezig zijn (figuur 3A, witte pijlpunten), maar zal verdwijnen bij het passeren. Veertien dagen na het zaaien zijn de van AL afgeleide organoïden volledig ontwikkeld (figuu...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.

Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Ons organoïde model is zeer waardevol om hypofyse stamcelbiologie te onderzoeken in homeostatische en hypofyse remodellering omstandigheden, zoals in neonatale rijping van de klier, veroudering-geassocieerde functionele achteruitgang, en tumorgroei in de klier. Tot op heden is onze hypofyse organoïde techniek het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen van muizen te laten groeien en uit te breiden. De procedure wordt gedemonstreerd door Emma Laporte en Charlotte Nys, promovendi in mijn onderzoeksgroep.Was om te beginnen de muizenkop met gedeïoniseerd water om het bloed te verwijderen. Spuit 70% ethanol op de kop om een steriele omgeving te genereren. Verwijder vervolgens de huid tussen de oren met behulp van steriele chirurgische hulpmiddelen.Om de schedel te openen, breek je de neusbrug met een steriele schaar. Open verder de schedel vanaf de neusbrug naar de oren aan beide zijden. Verwijder de schedel en de hersenen met een steriel pincet zonder de hypofyse aan te raken.Verwijder de diafragma sellae met een stomp pincet. Scheid vervolgens onder een stereomicroscoop de voorkwab van de achterste en tussenlobben. Isoleer de voorkwab zorgvuldig met een stomp pincet en verzamel deze in een Erlenmeyer van 10 milliliter met drie milliliter medium A.Voeg twee milliliter voorverwarmde 2,5% trypsine-oplossing toe.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg twee milliliter voorverwarmde DNAse-oplossing toe en draai de Erlenmeyer 10 keer rond. Laat de hypofyse naar de bodem zinken en verwijder het supernatant.Voeg twee milliliter voorverwarmde trypsineremmeroplossing toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder het bovennatuurlijk wanneer de hypofyse naar de bodem zinkt. Voeg twee milliliter voorverwarmd medium B toe en incubeer gedurende vijf minuten.Voeg hier twee milliliter voorverwarmd medium C aan toe en incubeer gedurende 15 minuten. Laat de hypofyse naar de bodem zinken en verwijder het supernatant. Spoel het vervolgens drie keer af met voorverwarmd medium C.Voeg twee milliliter voorverwarmd medium C.Aspiraat toe en verdrijft de hypofyse meerdere keren met een steriele, vlamgepolijste Pasteur-pipet totdat fragmenten niet meer zichtbaar zijn.Breng de suspensie over in een buis van 15 milliliter met 4,5 milliliter voorverwarmde DNAse-oplossing. Spoel de kolf driemaal af met twee milliliter voorverwarmd medium C en breng de suspensie over in de buis. Meng de verzamelde celsuspensie en filtreer deze door een celzeef van 40 micron in een buis van 30 milliliter.Spoel de buis en de celzeef drie keer met twee milliliter medium C en breng de suspensie over op de buis. Vul een glazen Pasteur pipet met twee milliliter BSA. Plaats de punt van de pipet aan de onderkant van de buis en pipetteer voorzichtig uit om een zichtbare dichtheidslaag te vormen.Centrifugeer 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in één milliliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Kwantificeer vervolgens de cellen met een celteller.Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Resuspend de celkorrel in geavanceerde DMEM/F-12 om een celdichtheid van 1,1 maal 10 tot de 6e cellen per milliliter te bereiken. Voeg ECM toe aan het gewenste volume celsuspensie in een verhouding van 30:70 en meng goed.Deponeer een druppel van 30 microliter van dit mengsel in elke put van een voorverwarmde plaat met 48 putten. Draai de plaat ondersteboven en laat de ECU 20 minuten stollen bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie voorzichtig 250 microliter voorverwarmd hypofyseorganoïde medium toe, aangevuld met 10-micromolaire ROCK-remmer.Verander om de twee tot drie dagen het medium zonder ROCK-remmer gedurende 10 tot 14 dagen totdat de organoïden volgroeid zijn. Om de organoïden te passeren, zuigt u eerst het medium voorzichtig op en voegt u 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM / F-12 toe om de ECM te desintegreren. Verzamel vervolgens de organoïden in een microcentrifugebuis.Was de put met 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 200 maal G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg 400 microliter voorverwarmd TrypLE Express-enzym toe.Meng door de buis meerdere keren om te keren en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12 toe. Centrifugeer vijf minuten bij 200 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant.Resuspend de pellet met 100 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Beperk een P-200-punt en gebruik de punt om de organoïden te dissociëren door krachtig te pipetteren totdat organoïdefragmenten zijn verkregen. Voeg 800 microliter geavanceerde DMEM/F-12 toe.Centrifugeer 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Om de organoïden te passeren, resuspendeert u de pellet in een voldoende volume geavanceerde DMEM / F-12 en voegt u ECM toe in een verhouding van 30: 70. Meng goed.Blijf de organoïden zaaien en kweken zoals beschreven in het teksthandschrift. Gedissocieerde afzonderlijke cellen van de voorkwab werden gezaaid in ECM en gekweekt in hypofyseorganoïde medium. 14 dagen na het zaaien waren de organoïden volledig ontwikkeld en bereikten ze een diameter van maximaal 500 micrometer.In dit stadium vertoonden de organoïden cystische morfologie met een epitheliale laag die een lumen omsluit. Het wordt niet aanbevolen om de putten te gebruiken waarin dichte structuren verschijnen na groei. Voor passageing werden organoïde fragmenten gebruikt voor het zaaien.Zeven dagen na het passeren werd gunstige organoïde hergroei waargenomen met cystische structuren. Dichte organoïden moeten worden weggegooid, omdat de ongunstige organoïden de cultuur kunnen overnemen. Immunofluorescentiekleuringsanalyse voor de epitheliale markers E-cadherine en cytokeratinen 8 en 18 bevestigde het epitheliale karakter van de organoïden.Expressie van hypofyse stamcelmarkers Sox2 en Trop2 toonde de stengelheid aan, en hypofyse-specifieke marker LHX3 toonde hypofysefenotype van de organoïden. Expressie van de marker Ki67 toonde aan dat de organoïde-constitutieve cellen zich in een proliferatieve toestand bevinden. RTQ PCR-analyse toonde een hogere expressie van stengelheidsmarkers in de organoïden dan in de voorkwab, zelfs na meerdere passages, wat de verrijking van stamcellen valideerde.Het is belangrijk om het juiste aantal afzonderlijke cellen in de ECM-koepel te plaatsen bij de eerste zaaiing, en bij het passeren van de organoïden moet men onthouden om fragmenten opnieuw te zaaien en geen enkele cellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...