Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

この研究は、ルーヴェン工科大学とフランダース科学研究基金(FWO)からの助成金によって支援されました。E.L. (11A3320N) および C.N. (1S14218N) は、FWO/FWO-SB の博士号フェローシップによってサポートされています。

本研究の動物実験は、ルーヴェン大学動物実験倫理委員会(P153/2018)により承認された。すべてのマウスは、標準化された条件(23±1.5°Cの一定温度、相対湿度40%〜60%、および12時間の昼夜サイクル)で大学の動物施設で飼育され、水と食物を 自由に利用できました。
1. マウス
<ol><li>C57BL/6Jマウスなど、若年成人年齢(8~12週齢)の市販のマウス系統を使用して...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

AL由来オルガノイドは、ここに記載されるように、下垂体幹細胞をインビトロで研究するための強力な研究モデルを表す。現在、このオルガノイドアプローチは、初代下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する下垂体オルガノイドモデルが以前に報告されており、これは下垂体胚...

下垂体は、脳の基部に位置する小さな内分泌腺であり、視床下部に接続されている。腺は、末梢および中枢(視床下部)入力を統合して、調整された調整されたホルモン放出を生成し、それによって下流の標的内分泌器官(副腎および生殖腺など)を調節して、適切なタイミングで適切なホルモンを産生する。下垂体は内分泌系の主要な調節因子であり、したがって正当にマスター腺1と呼ばれる。
マウスの下垂体は、3つの葉(図1)、すなわち、前葉(AL)、中間葉(IL)、および後葉(PL)からなる。主要な内分泌ALは、5つのホルモン細胞型を含みます, 成長ホルモンを産生するソマトトロープを含みます (GH);プロラクチン(PRL)を生成するラクトトロープ;副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を分泌するコルチコトロペ;甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生に関与する甲状腺綱;黄体形成ホルモン(LH)と卵胞刺激ホルモン(FSH)を作る性腺刺激薬。PLは、ホルモンオキシトシンおよびバソプレシン(抗利尿ホルモン)が貯蔵されている視床下部からの軸索突起からなる。ILはALとPLの間に位置し、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)を産生するメラノトロープを収容する。ヒト下垂体では、ILは発生中に退行し、メラノトロープはAL1内に広がる。内分泌細胞に加えて、下垂体はまた、転写因子SOX2 2,3,4,5,6によって本質的にマークされる幹細胞のプールを含む。これらのSOX2+細胞は、辺縁帯(MZ)に位置し、裂け目の上皮内層(ALとILとの間の胚性残骸内腔)、またはALの実質全体にクラスターとして広がっている、それによって腺内の2つの幹細胞ニッチ(図1)2、3、4、5、6を提案する。
下垂体の不可欠な性質を考えると、腺の機能不全は重篤な罹患率と関連している。下垂体亢進症(1つ以上のホルモンの過剰分泌を特徴とする)および下垂体機能低下症(1つ以上のホルモンの産生の欠損または欠損)は、下垂体神経内分泌腫瘍(PitNET;例えば、クッシング病につながるACTH産生腫瘍)または遺伝的欠陥(例えば、小人症をもたらすGH欠乏症)によって引き起こされ得る7。さらに、下垂体手術(例えば、腫瘍を除去するため)、感染症(例えば、視床下部 - 下垂体結核、または細菌性髄膜炎または脳炎に続く感染症)、シーハン症候群(出産時の大量の失血による血流不足による壊死)、下垂体脳卒中および外傷性脳損傷は、下垂体機能低下の他の重要な原因である8.マウス下垂体が再生能力を有していることが示されており、内分泌細胞のトランスジェニックアブレーションによって導入された局所損傷を修復できることが示されている9、10。SOX2+幹細胞は、活性化された表現型を示す傷害に鋭く反応し、増殖の亢進(幹細胞の増殖をもたらす)および幹関連因子および経路(例えば、WNT/NOTCH)の発現増加によって特徴付けられる。さらに、幹細胞はアブレーションされたホルモンを発現し始め、最終的に9、10以下の(5〜6)ヶ月にわたって枯渇した細胞集団の実質的な回復をもたらす。また、腺の新生児成熟期(生後最初の3週間)には、下垂体幹細胞は活性化状態で繁栄しています6,11,12,13が、生物の老化は、加齢(または「炎症」)時の炎症性(マイクロ)環境の増加により、その場で幹細胞の機能が低下することと関連しています10,14.さらに、腺における腫瘍形成は、幹細胞活性化にも関連している7、15。幹細胞の活性化は、下垂体リモデリングのいくつかの状況(7,16でレビュー)で検出されているが、根底にあるメカニズムは不明のままである。in vivoアプローチ(トランスジェニックマウスにおける系統追跡など)は下垂体幹細胞の明確または包括的な画像を提供していないため、正常および罹患下垂体における幹細胞生物学を探索するための信頼性の高いin vitroモデルの開発が不可欠である。初代下垂体幹細胞の標準的な体外培養は、非常に限られた増殖能力および表現型の急速な喪失を伴う非生理学的(2D)状態のために不十分のままである(より詳細な概要については、16を参照されたい)。3Dスフェア培養物(pituispheres)は、サイド集団およびSOX2+表現型2,3,4によって同定された下垂体幹細胞から樹立されている。ピツイスフェアは幹細胞からクローン的に成長し、ステムネスマーカーを発現し、内分泌細胞型への分化能を示す。しかし、それらは限られた通過性(2〜3通路)しか示さず、かなり拡大しない3,4。スフェア様構造体は、50%希釈マトリゲル中で1週間培養した場合、非解離下垂体幹細胞クラスターからも得られたが、拡張性は示されなかった17。ピトイスフェアアプローチは、主に幹細胞数の読み出しツールとして使用されますが、さらなる用途は、劣った膨張容量16によって制限されています。
これらの欠点に対処し、克服するために、MZおよび実質幹細胞を含むマウスの主要な内分泌ALから始まる新しい3Dモデル、すなわちオルガノイドが最近確立されている。オルガノイドが実際に下垂体の幹細胞に由来し、その表現型を忠実に再現していることが示されている18。さらに、オルガノイドは長期的に拡張可能であり、その茎の性質を堅牢に維持する。したがって、それらは、深遠な探査のために初代下垂体幹細胞を拡大するための信頼できる方法を提供する。このような探査は、下垂体から単離することができる限られた数の幹細胞では達成不可能であり、これもまた、2D条件16において拡張可能ではない。オルガノイドは、新しい下垂体幹細胞の特徴(in vivoに翻訳可能)を明らかにするための貴重で信頼性の高いツールであることが示されています14,18。重要なことに、オルガノイドモデルは、局所組織損傷および新生児成熟の間に起こる下垂体幹細胞活性化状態を忠実に反映し、増強された形成効率を示し、上方制御された分子経路を複製する14、18。したがって、下垂体由来オルガノイドモデルは、革新的で強力な下垂体幹細胞生物学研究モデルであり、幹細胞活性化読み出しツールでもあります。
このプロトコールは、マウス下垂体由来オルガノイドの樹立を詳細に記載する。この目的のために、ALは単離され、単一細胞に解離し、それらは細胞外マトリックス模倣マトリゲル(本明細書ではECMと呼ぶ)に埋め込まれる。次いで、細胞-ECMアセンブリーを、幹細胞増殖因子および下垂体胚調節因子を本質的に含む定義済みの培地(さらに「下垂体オルガノイド培地」(PitOM)18; 表1)。オルガノイドが完全に発達すると(10〜14日後)、それらはさらにトラフシーケンシャル継代に拡張され、広範な下流探査(例えば、免疫蛍光、RT-qPCR、およびバルクまたは単一細胞トランスクリプトミクス; 図1)。長期的には、下垂体幹細胞オルガノイドが組織修復アプローチや再生医療への道を開くことが期待されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

下垂体は、身体の成長、代謝、性的成熟、生殖、ストレス反応などの重要な生理学的プロセスを調節するマスター内分泌腺です。10年以上前、幹細胞は下垂体で同定されました。しかしながら、トランスジェニック in vivo アプローチの適用にもかかわらず、それらの表現型、生物学、および役割は不明のままである。この謎に取り組むために、下垂体幹細胞生物学を深く解明するために、新しく革新的なオルガノイド in vitro モデルが開発されています。オルガノイドは、定義された培養条件下で、組織の(上皮)幹細胞から自己発達し、それらの幹細胞およびその組織の複数の特徴を再現する3D細胞構造を表す。ここでは、マウスの下垂体由来オルガノイドが腺の幹細胞から発達し、 そのin vivo 表現型および機能的特徴を忠実に再現することが示されている。とりわけ、それらは、遺伝子導入的に加えられた局所的損傷に応答して生じる in vivo としての幹細胞の活性化状態を再現する。オルガノイドは、ステムネス表現型を堅牢に保持しながら、長期的に拡張可能である。この新しい研究モデルは、新生児の成熟から加齢に伴う退色、および健康な腺から罹患した腺に至るまで、下垂体リモデリングの重要な条件における幹細胞の表現型および挙動を解読するために非常に貴重である。ここでは、マウス下垂体由来オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルが提示され、これは下垂体幹細胞のまだ謎めいた世界に飛び込むための強力なツールを提供する。

ALの単離および解離後、得られた単一細胞をECMに播種し、PitOM中で増殖させる(図1、表1)。図3Aは、播種時(Day 0)の細胞培養および密度を示す。いくつかの小さな破片が存在するかもしれないが(図3A、白い矢印)、通過時に消える。播種後14日目に、AL由来オルガノイドは完全に発達する(図3A)。オ...

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Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

下垂体は、体の内分泌系の主要な調節因子である。この記事では、生物学的および機能がほとんど理解されていない腺の幹細胞集団を研究するための新しい3D in vitro モデルとして、マウス下垂体からのオルガノイドの開発を説明する。

下垂体幹細胞生物学を探るための In Vitro モデルとしてのマウス下垂体からのオルガノイドの開発

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

我々のオルガノイドモデルは、新生児腺の成熟、加齢に伴う機能低下、腺における腫瘍増殖など、恒常性および下垂体リモデリング条件における下垂体幹細胞生物学を探索するのに非常に貴重である。今日まで、私たちの下垂体オルガノイド技術は、初代マウス下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールです。手順を実証するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるEmma LaporteとCharlotte Nysです。まず、マウスの頭を脱イオン水で洗って血液を取り除きます。70%エタノールを頭部にスプレーして、無菌環境を生成する。その後、滅菌手術器具を用いて耳の間の皮膚を除去する。頭蓋を開くには、滅菌ハサミでノーズブリッジを壊します。さらに、鼻橋から両側の耳に向かって頭蓋を開きます。下垂体に触れることなく滅菌ピンセットで頭蓋と脳を取り除きます。ダイヤフラムセラを鈍いピンセットで取り外します。次いで、実体顕微鏡下で、前葉を後葉および中間葉から分離する。鈍いピンセットで前葉を慎重に分離し、3ミリリットルの培地Aを含む10ミリリットルの三角フラスコに集めます。摂氏37度で15分間インキュベートする。2ミリリットルの予め加温したDNAse溶液を加え、三角フラスコを10回旋回させる。下垂体を底に沈め、上清を取り除きます。予め加温したトリプシン阻害剤溶液2ミリリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。下垂体が底に沈んだら上澄み液を取り除きます。予め加温した培地Bを2ミリリットル加え、5分間インキュベートする。これに2ミリリットルの予め加温した培地Cを加え、15分間インキュベートする。下垂体を底に沈め、上清を取り除きます。その後、予め加温した培地C.2ミリリットルの予め加温した培地C.Aspirateを加え、無菌の火炎研磨パスツールピペットで下垂体を複数回排出し、断片が見えなくなるまで3回すすいでください。懸濁液を、4.5ミリリットルの予め加温されたDNAse溶液を含む15ミリリットルのチューブに移す。フラスコを2ミリリットルの予め加温した培地Cで3回すすぎ、懸濁液をチューブに移す。回収した細胞懸濁液を混合し、40ミクロンのセルストレーナーを通して30ミリリットルのチューブに濾過する。チューブとセルストレーナーを2ミリリットルの培地Cで3回すすぎ、懸濁液をチューブに移します。ガラスパスツールピペットに2ミリリットルのBSAを入れます。ピペットの先端をチューブの底に置き、静かにピペットを出して、目に見える密度層を形成します。Gの190倍で4°Cで10分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを1ミリリットルの氷冷高度DMEM/F-12に再懸濁する。次に、セルカウンターで細胞を定量する。細胞懸濁液を摂氏4度で10分間、190倍Gで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを高度なDMEM/F-12に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1.1倍の細胞密度に達する。ECMを所望の体積の細胞懸濁液に30:70の比率で加え、よく混合する。この混合物の30マイクロリットル滴を、予め加温した48ウェルプレートの各ウェルに堆積させる。プレートを裏返し、ECMを摂氏37度で20分間固化させます。インキュベーション後、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した250マイクロリットルの予め加温した下垂体オルガノイド培地を慎重に加える。2~3日ごとに、オルガノイドが完全に増殖するまでROCK阻害剤を含まない培地を10~14日間交換する。オルガノイドを通過させるには、まず培地を穏やかに吸引し、400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12を加えてECMを崩壊させる。次いで、オルガノイドを微量遠心管に集める。400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12で井戸を洗ってください。チューブを200倍Gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、予め加温したTrypLE Express酵素400マイクロリットルを加える。チューブを数回反転させて混合し、摂氏37度で5分間インキュベートする。400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12を加える。Gで200回で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを100マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12で再懸濁する。P-200先端を狭くし、その先端を使用して、オルガノイド断片が得られるまで激しくピペッティングすることにより、オルガノイドを解離させる。800マイクロリットルの高度なDMEM/F-12を追加します。4°Cで10分間Gを190回で遠心分離し、上清を除去した。オルガノイドを通過させるには、ペレットを適切な量の高度なDMEM/F-12で再懸濁し、ECMを30:70の比率で加える。よく混ぜる。テキスト原稿に記載されているようにオルガノイドを種まきし、培養し続ける。前葉から解離した単一細胞をECMに播種し、下垂体オルガノイド培地中で増殖させた。播種後14日後、オルガノイドは完全に発達し、最大500マイクロメートルの直径に達した。この段階で、オルガノイドは、内腔を囲む上皮層を有する嚢胞性形態を示した。成長後に緻密な構造が現れる井戸を使用することは推奨されません。継代のために、オルガノイド断片を播種に使用した。継代後7日目に、嚢胞構造で良好なオルガノイド再増殖が観察された。高密度オルガノイドは、好ましくないオルガノイドが培養物を引き継ぐ可能性があるため、廃棄する必要があります。上皮マーカーE-カドヘリンおよびサイトケラチン8および18についての免疫蛍光染色分析は、オルガノイドの上皮特性を確認した。下垂体幹細胞マーカーSox2およびTrop2の発現はステム性を示し、下垂体特異的マーカーLHX3はオルガノイドの下垂体表現型を示した。マーカーKi67の発現は、オルガノイド構成細胞が増殖状態にあることを示した。RTQ PCR解析では、複数回継代後においてもオルガノイドにおいて前葉よりもステムネスマーカーの発現が高いことが示され、幹細胞の濃縮性を検証した。最初の播種時にECMドーム内に適切な数の単一細胞をプレートすることが重要であり、オルガノイドを継代するときは、単一細胞ではなく断片を再播種することを忘れてはならない。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚幹細胞の誘導

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...