Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven Research Fund och Fund for Scientific Research (FWO) - Flandern. E.L. (11A3320N) och C.N. (1S14218N) stöds av ett Ph.D. Fellowship från FWO / FWO-SB.

Djurförsök för denna studie godkändes av KU Leuvens etiska kommitté för djurförsök (P153/2018). Alla möss var inrymda på universitetets djuranläggning under standardiserade förhållanden (konstant temperatur på 23 ± 1,5 ° C, relativ luftfuktighet 40% -60% och en dag / nattcykel på 12 timmar), med tillgång till vatten och mat ad libitum.
1. Möss
<ol><li>Använd kommersiellt tillgängliga musstammar, såsom C57BL / 6J-möss, i ung vuxen ålder (8-12 ...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

De AL-härledda organoiderna, som beskrivs här, representerar en kraftfull forskningsmodell för att studera hypofysstamceller in vitro. För närvarande är detta organoida tillvägagångssätt det enda tillgängliga verktyget för att på ett tillförlitligt och robust sätt odla och expandera primära hypofysstamceller. En hypofysorganoidmodell som härrör från embryonala stamceller (ESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) har rapporterats tidigare, som nära rekapitulerar hypofysembryonal or...

Hypofysen är en liten endokrin körtel som ligger vid hjärnans botten, där den är kopplad till hypotalamus. Körteln integrerar perifera och centrala (hypotalamiska) ingångar för att generera en avstämd och samordnad hormonfrisättning och därigenom reglera nedströms mål endokrina organ (såsom binjurar och gonader) för att producera lämpliga hormoner vid rätt tidpunkt. Hypofysen är nyckelregulatorn för det endokrina systemet och kallas därför med rätta masterkörteln1.
Musens hypofys består av tre lober (figur 1), dvs den främre loben (AL), mellanloben (IL) och den bakre loben (PL). Den stora endokrina AL innehåller fem hormonella celltyper, inklusive somatotroper som producerar tillväxthormon (GH); laktotroper som genererar prolaktin (PRL); kortikotroper som utsöndrar adrenokortikotropt hormon (ACTH); tyrotroper som är ansvariga för sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) produktion; och gonadotroper som gör luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). PL består av axonala projektioner från hypotalamus där hormonerna oxytocin och vasopressin (antidiuretiskt hormon) lagras. IL ligger mellan AL och PL och rymmer melanotroper som producerar melanocytstimulerande hormon (MSH). I den mänskliga hypofysen regresserar IL under utvecklingen, och melanotroper sprids inom AL1. Förutom de endokrina cellerna innehåller hypofysen också en pool av stamceller, väsentligen markerade med transkriptionsfaktorn SOX2 2,3,4,5,6. Dessa SOX2+ -celler är belägna i marginalzonen (MZ), epitelfodret i klyftan (en embryonal restlumen mellan AL och IL), eller sprids som kluster genom AL: s parenkym och föreslår därmed två stamcellsnischer i körteln (Figur 1) 2,3,4,5,6.
Med tanke på hypofysens oumbärliga natur är funktionsfel i körteln förknippad med allvarlig sjuklighet. Hyperpituitarism (kännetecknad av översekretion av ett eller flera hormoner) och hypopituitarism (defekt eller saknad produktion av ett eller flera hormoner) kan orsakas av hypofysneuroendokrina tumörer (PitNETs; t.ex. ACTH-producerande tumörer som leder till Cushings sjukdom) eller av genetiska defekter (t.ex. GH-brist som resulterar i dvärgväxt)7. Dessutom är hypofyskirurgi (t.ex. för att avlägsna tumörer), infektioner (t.ex. hypotalamus-hypofys tuberkulos eller infektioner efter bakteriell meningit eller encefalit), Sheehans syndrom (nekros på grund av otillräckligt blodflöde på grund av kraftig blodförlust vid födseln), hypofysapoplexi och traumatisk hjärnskada andra viktiga orsaker till hypofyshypofunktion8 . Det har visat sig att mushypofysen har den regenerativa kapaciteten och kan reparera lokala skador som införs genom transgen ablation av endokrina celler 9,10. SOX2+-stamcellerna reagerar akut på den orsakade skadan som visar en aktiverad fenotyp, markerad av ökad proliferation (vilket resulterar i stamcellsexpansion) och ökat uttryck av stamhetsrelaterade faktorer och vägar (t.ex. WNT / NOTCH). Dessutom börjar stamcellerna uttrycka det ablaterade hormonet, vilket slutligen resulterar i en väsentlig återställning av den utarmade cellpopulationen under följande (5 till 6) månader 9,10. Under körtelns neonatala mognadsfas (de första 3 veckorna efter födseln) trivs hypofysstamcellerna i ett aktiverat tillstånd 6,11,12,13, medan organismens åldrande är förknippat med minskad in situ-stamcellsfunktionalitet på grund av en ökande inflammatorisk (mikro-) miljö vid åldrande (eller "inflammatorisk")10,14 . Dessutom är tumorigenes i körteln också associerad med stamcellsaktivering 7,15. Även om stamcellsaktivering har upptäckts i flera situationer med hypofysombyggnad (granskad i 7,16), är underliggande mekanismer fortfarande oklara. Eftersom in vivo-metoder (såsom härstamningsspårning hos transgena möss) inte har gett en tydlig eller heltäckande bild av hypofysstamceller, är utvecklingen av tillförlitliga in vitro-modeller för att utforska stamcellsbiologi i normal och sjuk hypofys avgörande. Standard in vitro-odling av primära hypofysstamceller är fortfarande otillräcklig på grund av mycket begränsad tillväxtkapacitet och icke-fysiologiska (2D) tillstånd med snabb förlust av fenotyp (för en mer detaljerad översikt, se16). 3D-sfärkulturer (hypofyssfärer) har etablerats från hypofysstamceller som identifierats av sidopopulationen och SOX2+ fenotyp 2,3,4. Hypouisfärerna växer klonalt från stamcellerna, uttrycker stamhetsmarkörer och visar differentieringskapacitet i de endokrina celltyperna. De expanderar dock inte nämn nämnbart samtidigt som de endast visar begränsad passage (2-3 passager)3,4. Sfärliknande strukturer erhölls också från icke-dissocierade hypofysstamcellskluster när de odlades i 50% utspädd Matrigel i 1 vecka, men expanderbarhet visades inte17. Pituisphere-metoden används mest som ett avläsningsverktyg för stamcellsnummer, men ytterligare tillämpningar begränsas av sämre expansionskapacitet16.
För att ta itu med och övervinna dessa brister har en ny 3D-modell nyligen etablerats, dvs organoider, med utgångspunkt från den stora endokrina AL hos möss som innehåller MZ och parenkymala stamceller. Det har visat sig att organoiderna verkligen härrör från hypofysens stamceller och troget rekapitulerar deras fenotyp18. Dessutom är organoiderna långsiktigt expanderbara, samtidigt som de robust bibehåller sin stamhetsnatur. Därför ger de en tillförlitlig metod för att expandera primära hypofysstamceller för djupgående utforskning. En sådan utforskning kan inte uppnås med det begränsade antalet stamceller som kan isoleras från en hypofys, som inte heller kan expanderas under 2D-förhållanden16. Det har visat sig att organoiderna är värdefulla och tillförlitliga verktyg för att avslöja nya hypofysstamcellsegenskaper (översättbara till in vivo)14,18. Viktigt är att organoidmodellen troget speglar hypofysstamcellsaktiveringsstatusen som inträffar under lokal vävnadsskada och neonatal mognad, vilket visar förbättrad bildningseffektivitet och replikerar uppreglerade molekylära vägar14,18. Därför är den hypofys-härledda organoidmodellen en innovativ och kraftfull forskningsmodell för hypofysstamcellsbiologi samt ett stamcellsaktiveringsavläsningsverktyg.
Detta protokoll beskriver i detalj upprättandet av mus hypofys-härledda organoider. För detta syfte isoleras AL och dissocieras i enskilda celler, vilka är inbäddade i extracellulär matris-efterliknande Matrigel (nedan kallad ECM). Cell-ECM-sammansättningen odlas sedan i ett definierat medium, som i huvudsak innehåller stamcellstillväxtfaktorer och hypofysembryonala regulatorer (vidare kallat hypofysorganoidmedium (PitOM)18; Tabell 1). När organoiderna är fullt utvecklade (efter 10-14 dagar) kan de expanderas ytterligare genom sekventiell genomströmspassage och utsättas för omfattande nedströms prospektering (t.ex. immunofluorescens, RT-qPCR och bulk- eller encellstranskriptomik; Figur 1). På längre sikt förväntas hypofysstamcellsorganoiderna bana väg för vävnadsreparationsmetoder och regenerativ medicin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

Hypofysen är den mästerliga endokrina körteln som reglerar viktiga fysiologiska processer, inklusive kroppstillväxt, ämnesomsättning, sexuell mognad, reproduktion och stressrespons. För mer än ett decennium sedan identifierades stamceller i hypofysen. Trots tillämpningen av transgena in vivo-metoder är deras fenotyp, biologi och roll fortfarande oklara. För att ta itu med denna gåta utvecklas en ny och innovativ organoid in vitro-modell för att djupt riva upp hypofysstamcellsbiologi. Organoider representerar 3D-cellstrukturer som, under definierade odlingsförhållanden, själv utvecklas från en vävnads (epitel) stamceller och rekapitulerar flera kännetecken för dessa stamceller och deras vävnad. Det visas här att mus hypofys-härledda organoider utvecklas från körtelns stamceller och troget rekapitulerar deras in vivo fenotypiska och funktionella egenskaper. Bland annat reproducerar de aktiveringstillståndet hos stamcellerna som in vivo som uppstår som svar på transgeniskt orsakad lokal skada. Organoiderna är långsiktigt expanderbara samtidigt som de robust behåller sin stamfenotyp. Den nya forskningsmodellen är mycket värdefull för att dechiffrera stamcellernas fenotyp och beteende under viktiga förhållanden för hypofysombyggnad, allt från neonatal mognad till åldringsassocierad blekning och från friska till sjuka körtlar. Här presenteras ett detaljerat protokoll för att etablera mus hypofys-härledda organoider, som ger ett kraftfullt verktyg för att dyka in i den ännu gåtfulla världen av hypofysstamceller.

Efter isolering och dissociation av AL frös de erhållna enskilda cellerna i ECM och odlas i PitOM (figur 1, tabell 1). Figur 3A visar cellkulturen och densiteten vid sådd (dag 0). Vissa små skräp kan vara närvarande (figur 3A, vita pilspetsar), men kommer att försvinna vid passering. Fjorton dagar efter sådd är de AL-härledda organoiderna fullt utvecklade (figur 3A). Organoide...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Hypofysen är nyckelregulatorn för kroppens endokrina system. Denna artikel beskriver utvecklingen av organoider från musens hypofys som en ny 3D in vitro-modell för att studera körtelns stamcellspopulation av vilken biologin och funktionen förblir dåligt förstådd.

Utveckling av organoider från mus hypofysen som in vitro-modell för att utforska hypofysstamcellsbiologi

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Vår organoidmodell är mycket värdefull för att utforska hypofysstamcellsbiologi vid såväl homeostatiska som hypofysremodelleringsförhållanden, såsom vid neonatal mognad av körteln, åldringsassocierad funktionell nedgång och tumörtillväxt i körteln. Hittills är vår hypofysorganoidteknik det enda tillgängliga verktyget för att på ett tillförlitligt och robust sätt växa och expandera primära mus hypofysstamceller. Demonstrerar proceduren gör Emma Laporte och Charlotte Nys, doktorander i min forskargrupp.För att börja, tvätta mushuvudet med avjoniserat vatten för att ta bort blodet. Spraya 70% etanol på huvudet för att generera en steril miljö. Ta sedan bort huden mellan öronen med sterila kirurgiska verktyg.För att öppna kraniet, bryt näsbryggan med steril sax. Öppna kraniet ytterligare från näsbryggan mot öronen på båda sidor. Ta bort kraniet och hjärnan med steril pincett utan att röra hypofysen.Ta bort membranet sellae med trubbig pincett. Sedan, under ett stereomikroskop, separera den främre loben från de bakre och mellanliggande loberna. Isolera försiktigt den främre loben med trubbig pincett och samla den i en 10 ml Erlenmeyerkolv innehållande tre milliliter medium A.Tillsätt två milliliter förvärmd 2,5% trypsinlösning.Inkubera vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Tillsätt två milliliter förvärmd DNAse-lösning och virvla Erlenmeyerkolven 10 gånger. Låt hypofysen sjunka till botten och ta bort supernatanten.Tillsätt två milliliter förvärmd trypsinhämmarlösning och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Ta bort supernatanten när hypofysen sjunker till botten. Tillsätt två milliliter förvärmt medium B och inkubera i fem minuter.Tillsätt två milliliter förvärmt medium C till detta och inkubera i 15 minuter. Låt hypofysen sjunka till botten och ta bort supernatanten. Skölj sedan det tre gånger med förvärmt medium C.Tillsätt två milliliter förvärmt medium C.Aspirera och utvisa hypofysen med en steril, flampolerad Pasteurpipett flera gånger tills fragment inte är synliga längre.Överför suspensionen till ett 15-milliliters rör innehållande 4,5 ml förvärmd DNAse-lösning. Skölj kolven tre gånger med två milliliter förvärmt medium C och överför suspensionen till röret. Blanda den uppsamlade cellsuspensionen och filtrera den genom en 40-mikron cellsil i ett 30-milliliters rör.Skölj röret och cellsilen tre gånger med två milliliter medium C och överför suspensionen till röret. Fyll en pasteurpipett i glas med två milliliter BSA. Placera pipettens spets längst ner på röret och pipettera försiktigt ut för att bilda ett synligt densitetsskikt.Centrifug vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i en milliliter iskall avancerad DMEM/F-12. Kvantifiera sedan cellerna med en cellräknare.Centrifugera cellsuspensionen vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. Resuspend cellpelleten i avancerad DMEM / F-12 för att nå en celldensitet på 1,1 gånger 10 till 6: e cellerna per milliliter. Tillsätt ECM till önskad volym cellsuspension i ett förhållande av 30:70 och blanda väl.Deponera en 30-mikroliter droppe av denna blandning i varje brunn av en förvärmd 48-brunnsplatta. Vänd plattan upp och ner och låt ECM stelna vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Efter inkubationen tillsätt försiktigt 250 mikroliter förvärmt hypofysorganoidmedium kompletterat med 10-mikromolär ROCK-hämmare.Varannan till var tredje dag, byt medium utan ROCK-hämmare i 10 till 14 dagar tills organoiderna är fullvuxna. För att passera organoiderna, aspirera först mediet försiktigt och tillsätt 400 mikroliter iskall avancerad DMEM / F-12 för att sönderdela ECM. Samla sedan organoiderna i ett mikrocentrifugrör.Tvätta brunnen med 400 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Centrifugera röret vid 200 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och tillsätt 400 mikroliter förvärmt TrypLE Express-enzym.Blanda genom att invertera röret flera gånger och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Lägg till 400 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Centrifug vid 200 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten.Resuspend pelletsen med 100 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Begränsa en P-200-spets och använd spetsen för att dissociera organoiderna genom att kraftigt pipettera tills organoidfragment erhålls. Lägg till 800 mikroliter avancerad DMEM/F-12.Centrifugera vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. För att passera organoiderna, återsuspendera pelletsen i en tillräcklig volym avancerad DMEM / F-12 och tillsätt ECM i ett förhållande av 30:70. Blanda väl.Fortsätt att frö och odla organoiderna som beskrivs i textmanuskriptet. Dissocierade enstaka celler från den främre loben såddes i ECM och odlades i hypofysorganoidmedium. 14 dagar efter sådd var organoiderna fullt utvecklade och nådde en diameter på upp till 500 mikrometer.I detta skede uppvisade organoiderna cystisk morfologi med ett epitelskikt som omsluter en lumen. Det rekommenderas inte att använda brunnarna där täta strukturer uppträder efter tillväxt. För passering användes organoidfragment för sådd.Sju dagar efter passering observerades gynnsam organoid återväxt med cystiska strukturer. Täta organoider bör kasseras, eftersom de ogynnsamma organoiderna kan ta över kulturen. Immunofluorescensfärgningsanalys för epitelmarkörerna E-kadherin och cytokeratiner 8 och 18 bekräftade organoidernas epitelkaraktär.Uttryck av hypofysstamcellsmarkörer Sox2 och Trop2 visade stamheten, och hypofysspecifik markör LHX3 visade hypofysfenotyp hos organoiderna. Uttrycket av markören Ki67 visade att de organoidbildande cellerna är i ett proliferativt tillstånd. RTQ PCR-analys visade högre uttryck av stamhetsmarkörer i organoiderna än i den främre loben även efter flera passager, vilket validerade anrikningen av stamceller.Det är viktigt att platta lämpligt antal enskilda celler i ECM-kupolen vid den första sådden, och när man passerar organoiderna måste man komma ihåg att åter fröfragment och inte enskilda celler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetiska Konvertering som en säker och enkel metod för att få insulinfrisättande cellerna från sex hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv isolering av funktionella cellöar från nyfödda mus bukspottkörteln

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Härledning av stamcellslinjer från musembryon preimplantatorisk

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion och koronalt Slice förberedelse att utveckla mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analys av hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes använder hela Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...