Name: double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Dr. Hudson W. P. de Carvalho por el apoyo para desarrollar este trabajo. Los autores también están agradecidos al Laboratorio de Microscopía Electrónica ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' por proporcionar la instalación de microscopía de luz. Los autores agradecen a la Dra. Flávia Rodrigues Alves Patrício por suministrar lesiones al material vegetal.

1. Preparación de la solución tampón y los reactivos
<ol><li>Prepare un tampón de cacodilato de 2 M agregando 4.28 g de cacodilato de sodio a 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.25 con 0.2 N HCl.</li>
	<li>Preparar 100 mL de la solución fijadora karnovsky mezclando 10 mL de glutaraldehído acuoso al 25%, 10 mL de formaldehído acuoso al 10%, 25 mL de tampón de cacodilato al 25% y 0,5 mL de CaCl2 26 M. Enrasar el volumen hasta 100 mL con agua destilada.<b...

<ol>
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El presente trabajo introduce una prueba histoquímica alternativa de doble tinción para investigar la composición de pectina de las paredes celulares que encapsula la haustoria en un patológico biotrófico. El objetivo también es demostrar la eficacia del método para detectar hongos necrotróficos y cambios en la pared celular inducidos por él. Aquí, la pectina de las paredes celulares del parénquima del café puede encapsular tanto el cuello como el haustorio del hongo de la roya Hemileia vastatrix. Si...

Los mecanismos de defensa de la pared celular en las plantas son cruciales para contener la infección por hongos. Los estudios han reportado cambios en el grosor y la composición de la pared celular desde elsiglo 19 1,2. Estos cambios pueden ser inducidos por un patógeno fúngico que estimula la formación de una papila, que impide que los hongos entren en la célula o podría usarse para encapsular las hifas para aislar el protoplasto de la célula huésped de la haustoria fúngica. La producción de una barrera dinámica de la pared celular (es decir, papilas y un haustorio completamente encerrado) es importante para promover la resistencia de la planta3. Los estudios histopatológicos sobre enfermedades relacionadas con hongos han investigado la aparición de estos mecanismos y han descrito los polímeros de la pared celular, la celulosa, la hemicelulosa (arabinoxilanos) y la callosa como mecanismos de resistencia al ataque fúngico 4,5,6,7.
La pared celular es la primera barrera contra el ataque de microorganismos, perjudicando la interacción planta-hongo. Los polisacáridos pécticos componen la pared celular y representan aproximadamente el 30% de la composición de la pared celular en las células primarias de las plantas eudicot en las que los homogalacturonanos son el polímero más abundante (aproximadamente el 60%)8. El Golgi secreta compuestos complejos de pectina que componen las cadenas de ácido galacturónico, que pueden o no estar metilados 8,9. Desde 2012, la literatura ha señalado que el grado de esterificación metilo de pectina es crítico para determinar la compatibilidad durante la infección por enzimas pécticas microbianas 10,11,12. Por lo tanto, se requieren protocolos para verificar la presencia y distribución de compuestos pécticos en los patosistemas planta-fúngico.
Se han utilizado diversas técnicas para detectar la encapsulación de papilas o haustorias. Los métodos de referencia utilizados son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de tejido fijo y la microscopía de luz de tejidos vivos y fijos. En cuanto a tem, varios estudios han demostrado el papel estructural de las aposiciones de la pared celular en la resistencia fúngica 13,14,15,16, y que el uso de lectinas y anticuerpos es un método intrincado para localizar polímeros de carbohidratos16. Sin embargo, los estudios muestran que la microscopía de luz es un enfoque importante y que las herramientas histoquímicas e inmunohistoquímicas permiten una mejor comprensión de la composición de las papilas y el revestimiento de haustorio 6,7.
Los hongos patógenos muestran dos tipos principales de estilos de vida: biotróficos y necrotróficos. Los hongos biotróficos dependen de las células vivas para su nutrición, mientras que los hongos necrotróficos matan a las células huésped y luego viven en los tejidos muertos17. En América Latina, la roya de la hoja del café, causada por el hongo Hemileia vastatrix, es una enfermedad importante en los cultivos de café18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamiento biotrófico y, entre los cambios estructurales observados en especies o cultivares de café resistentes, se ha reportado una respuesta de hipersensibilidad, deposición de callosa, celulosa y lignina en las paredes celulares, así como hipertrofia celular14. Según el conocimiento de los autores, la literatura no informa sobre la importancia de la pectina en la resistencia a la roya del café. Por otro lado, los hongos necrotróficos que causan cercosporiosis se dirigen a la pectina a través de un conjunto de enzimas asociadas con la degradación de la pared celular, como las pectinasas y la poligalacturonasa20. La cercosporiosis en el café, causada por el hongo Cercospora coffeicola, también es una amenaza importante para los cultivos de café21,22. Este hongo causa lesiones necróticas tanto en las hojas como en las bayas. Después de la penetración, C. coffeicola coloniza los tejidos vegetales a través de las vías intracelulares e intercelulares 23,24,25.
El presente protocolo investiga la presencia de estructuras fúngicas y pectina en las paredes celulares. Este protocolo es útil para identificar la respuesta de la planta asociada con la pectina (teñida con colorante rojo rutenio, que es específico de los grupos ácidos ácidos poliurónicos de la pectina), inducida por el huésped en una interacción biotrófica con el hongo. También ayuda a verificar el efecto de los hongos necrotróficos en la degradación de las paredes celulares pécticas. Los presentes resultados indican que el método de doble tinción es eficaz para discriminar estructuras y la fase reproductiva de los hongos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blades DB80 HS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838383</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EMS</td>
			<td># 11652</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Blue Lactophenol</td>
			<td>Metaqu&#237;mica</td>
			<td>70SOLSIG024629</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15712</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#16216</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Historesin Kit</td>
			<td>Technovit /EMS</td>
			<td>#14653</td>
			<td>Historesin for embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Dubesser</td>
			<td>SSCD25X30-110V</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#490040-0030-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome (Leica RM 2540)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>149BIO000C1 14050238005</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic molding cup tray</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10176-30</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruthenium red</td>
			<td>LABHouse</td>
			<td>#006004</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axion Vision</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#410130-0909-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Prismatec</td>
			<td>131 TIPO 2 V.C.</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction

Las células vegetales utilizan diferentes mecanismos estructurales, ya sean constitutivos o inducibles, para defenderse de la infección por hongos. La encapsulación es un mecanismo inducible eficiente para aislar los haustorios fúngicos del protoplasto de células vegetales. Por el contrario, la pectina, uno de los componentes poliméricos de la pared celular, es un objetivo de varias enzimas pectolíticas en interacciones necrotróficas. Aquí, se presenta un protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas a través de microscopía óptica. Se investiga la encapsulación rica en pectina en las células de las hojas de café infectadas por el hongo de la roya Hemileia vastatrix y la modificación de la pared celular mesófila inducida por Cercospora coffeicola . Las muestras de hojas lesionadas se fijaron con la solución de Karnovsky, se deshidrataron y se incrustaron en metacrilato de glicol durante 2-4 días. Todos los pasos fueron seguidos por el bombeo de vacío para eliminar el aire en los espacios intercelulares y mejorar el proceso de incrustación. Los bloques incrustados se seccionaron en secciones de 5-7 μm de espesor, que se depositaron en un portaobjetos de vidrio cubierto con agua y posteriormente se calentaron a 40 ° C durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se tiñeron dos veces con 5% de azul algodón en lactofenol para detectar el hongo y 0,05% de rojo rutenio en agua para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina). Se encontró que los haustorios fúngicos de Hemileia vastatrix estaban encapsulados por pectina. En la cercosporiosis del café, las células mesófilas exhibieron disolución de las paredes celulares, y se observaron hifas y conidióforos intercelulares. El método presentado aquí es efectivo para detectar una respuesta asociada a la pectina en la interacción planta-hongo.

La tinción de lactofenol azul algodón en la sección incrustada en GMA reveló la presencia de varias estructuras fúngicas entre y dentro de las células mesófilas del café en las interacciones fúngicas biotróficas y necrotróficas.
En el patosistema biotrófico, cuando se tiñe utilizando el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contienen paredes celulares y el contenido denso de protoplastos aparecen en azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso co...

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Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Este protocolo describe un método microscópico para detectar la pectina en la interacción café-hongo.

Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Este protocolo es significativo ya que permite identificar la interacción planta-hongo. Además de colorear la pectina, también demuestra defectos en el polímero de la pared celular del patógeno y permite la identificación de estructuras de hongos. Esta técnica simple y sin complicaciones se puede realizar utilizando microscopía de luz y no requiere ningún equipo costoso, como el microscopio electrónico de barrido.Además, es una técnica rápida que obtiene una excelente distinción de estructuras vegetales para estudios histopatológicos. La técnica identifica la interacción planta-hongo. De ahí que colabore en el diagnóstico de las enfermedades causadas por hongos biotróficos y necrotróficos como la roya del café y la cercosporiosis.Para comenzar, cosecha una muestra de hoja de aproximadamente 10 milímetros cuadrados en la región media de la lesión con un bisturí y una pinza, y sumérgela en 30 mililitros de solución fijadora Karnovsky. Someta la muestra de hoja a un bajo vacío de 500 a 600 milibares durante 15 minutos utilizando una bomba de aceite, al menos cuatro veces para aumentar la permeabilidad de la solución fijadora en el tejido de la hoja. Después de la fijación, lave la muestra de la hoja tres veces en tampón de cacodilato de 0,5 M diluido en agua destilada durante cinco minutos cada uno, y luego transfiérala a una serie etanólica graduada durante 15 minutos en cada concentración de etanol.Para transferir gradualmente las muestras al metacrilato de glicol, haga la Solución A mezclando un gramo de polvo de metacrilato de glicol con 100 mililitros de resina básica bajo agitación magnética. Luego, sumerja las muestras en una proporción de uno a dos de Solución A y 100% etanol durante tres horas. Sumerja las muestras en una proporción de uno a uno para la solución A: 100% etanol durante tres horas, luego sumérjalas en una resina básica pura durante dos a cuatro días.Someta la muestra a un vacío bajo al menos cuatro veces al día durante 15 minutos, seguido de rotación. Mezclar 15 mililitros de la Solución A con un mililitro del endurecedor en un vaso de precipitados con rotación durante dos minutos para producir la Solución de polimerización B.Poner 1,2 mililitros de esta Solución de polimerización B en moldes de plástico. Usando un pico de madera, transfiera las muestras de hojas lesionadas de resina básica pura a la Solución B y evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento de tejidos.Asegúrese de orientar rápidamente las muestras de hojas perpendiculares a los moldes de plástico, ya que la Solución B se vuelve viscosa rápidamente. Cuando se logre la orientación perpendicular de las muestras de hojas, espere 30 minutos y luego transfiera el molde de plástico a una cámara de plástico o vidrio que contenga gel de sílice para evitar la humedad. Una vez que la resina y la muestra de la hoja se polimerizan después de dos o tres horas, separe el bloque resultante del molde de plástico lijando la base del bloque con una lima de lijado.Luego, pegue el bloque a un trozo de madera. Corte el bloque en secciones de cinco micrómetros de espesor utilizando un microtomo giratorio equipado con cuchillas de acero de ocho centímetros. Coloque las secciones en toboganes de vidrio cubiertos con agua destilada.Luego, transfiera las diapositivas a una placa caliente para que se sequen a 40 grados centígrados y promuevan la adhesión de las secciones a las diapositivas de vidrio. Después del secado, etiquete las diapositivas de vidrio con el nombre de referencia del bloque y el número de diapositiva. Cubra las secciones con dos mililitros de azul de algodón al 5% en lactofenol y caliéntelas en una placa caliente a 45 grados centígrados durante cinco minutos.Retire el exceso de tinte lavando el portaobjetos tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada. Mancharlo con dos mililitros de rojo rutenio al 0,01% en agua durante un minuto. Retire el exceso de tinte lavando el portaobjetos tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada.Coloque una gota de agua destilada sobre las secciones y cubra las secciones con un resbalón de cubierta para realizar análisis de microscopía de luz. En el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contenían paredes celulares y el denso contenido de protoplastos aparecieron de color azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso como en el de empalizada. La célula madre de haustorium y la haustoria también exhibieron un color azul oscuro.La contramancha con rojo rutenio definió claramente la distribución fúngica en los espacios intercelulares. Durante la interacción, la célula madre de Hemileia vastatrix haustorium rompió la pared celular huésped y desarrolló un cuello haustorial rodeado de compuestos pécticos. La encapsulación de color rosa-rojo rica en pectina del cuello haustorial no puede prevenir la formación haustorial.En algunos casos, la encapsulación rica en pectina encerró el haustorio incompletamente. Y en algunos casos, el haustorio está completamente encapsulado. La pared celular rica en pectina mantiene la integridad en el borde de la lesión, donde el hongo no está presente.El método de doble tinción demostró la presencia de hifas intercelulares. En las zonas de interacción, las paredes celulares de pectina parecían perder su integridad debido a la disolución. Las estructuras reproductivas como los conidios se encontraron en la epidermis adaxial.Las hifas de Cercospora coffeicola se encontraron en la cámara subestomática como estructuras de rizo, y el parénquima de empalizada en la región de la lesión parece someterse a lisis de la pared celular. Evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento del tejido. Se deben realizar estudios histopatológicos adicionales sobre royas, antracnosis, cercosporiosis, smuts y otras interacciones planta-hongo biotróficas, hemibiotróficas y necrotróficas para investigar el uso potencial de esta técnica en diferentes patosistemas.

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