Name: double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr. Hudson W. P. de Carvalho för stödet för att utveckla detta arbete. Författarna är också tacksamma för laboratoriet för elektronmikroskopi '' Prof. Elliot Watanabe Kitajima '' för att tillhandahålla ljusmikroskopianläggningen. Författarna tackar Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício för att ha försett växtmaterialet med skador.

1. Beredning av buffertlösningen och reagenserna
<ol><li>Förbered 2 M kacodylatbuffert genom att tillsätta 4,28 g natriumkacodylat till 100 ml destillerat vatten och justera pH till 7,25 med 0,2 N HCl.</li>
	<li>Förbered 100 ml av Karnovsky fixativ lösning genom att blanda 10 ml 25% vattenhaltig glutaraldehyd, 10 ml 10% vattenhaltig formaldehyd, 25 ml 2 M kacodylatbuffert och 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Gör upp volymen till 100 ml med destillerat vatten. OBS: Lösn...

<ol>
	<li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi.">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).</li><li>Mangin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+the+Peronospores.">Research on the Peronospores.</a> Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).</li><li>Underwood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+a+dynamic+barrier+against+pathogen+invasion.">The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).</li><li>Hu&#776;ckelhoven, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-associated+mechanisms+of+disease+resistance+and+susceptibility.">Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).</li><li>Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Callose-mediated+resistance+to+pathogenic+intruders+in+plant+defense-related+papillae.">Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).</li><li>Chowdhury, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+accumulation+of+callose,+arabinoxylan+and+cellulose+in+nonpenetrated+versus+penetrated+papillae+on+leaves+of+barley+infected+with+Blumeria+graminis+f.+sp.+Hordei.">Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei.</a> New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).</li><li>Caffall, K. H., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure,+function,+and+biosynthesis+of+plant+cell+wall+pectic+polysaccharides.">The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).</li><li>Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+wall.">The cell wall.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).</li><li>Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl+esterification+of+pectin+plays+a+role+during+plant-pathogen+interactions+and+affects+plant+resistance+to+diseases.">Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases.</a> Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).</li><li>Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectoplate:+the+simultaneous+phenotyping+of+pectin+methylesterases,+pectinases,+and+oligogalacturonides+in+plants+during+biotic+stresses.">Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).</li><li>Lionetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+pectin+methylesterase+inhibitors+protect+cell+wall+integrity+for+Arabidopsis+immunity+to+Botrytis.">Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis.</a> Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).</li><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haustorium+sheath+formation+in+cowpea+leaves+immune+to+rust+infection.">Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection.</a> Phytopathology. 61, 383-388 (1971).</li><li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee+resistance+to+the+main+diseases:+leaf+rust+and+coffee+berry+disease.">Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease.</a> Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).</li><li>An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+effects+on+root+cell+wall+composition+and+ion+contents+in+two+soybean+cultivars+under+salinity+stress.">Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress.</a> Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+smut:+shedding+light+on+the+development+of+the+whip-shaped+sorus.">Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus.</a> Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).</li><li>Delaye, L., Garc&#237;a-Guzm&#225;n, G., Heil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytes+versus+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens-are+fungal+lifestyles+evolutionarily+stable+traits.">Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits.</a> Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).</li><li>Avelino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+rust+crises+in+Colombia+and+Central+America+(2008-2013):+impacts,+plausible+causes+and+proposed+solutions.">The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions.</a> Food Security. 7, 303-321 (2015).</li><li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+management+of+coffee+leaf+rust+in+Brazil.">Current status and management of coffee leaf rust in Brazil.</a> Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).</li><li>Swiderska-Burek, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytopathogenic+Cercosporoidfungi-from+taxonomy+to+modern+biochemistry+and+molecular+biology.">Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).</li><li>Andrade, C. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves.">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li><li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee+tree+diseases.">Coffee tree diseases.</a> Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).</li><li>Casta&#241;o, A. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee+rust.">Coffee rust.</a> Informative report Cenicaf&#233;. 82, 313-327 (1956).</li><li>Echandi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee+rust,+caused+by+the+fungus+Cercospora+coffeicola.">Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola.</a> Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).</li><li>Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+process+of+Cercospora+coffeicola+on+coffee+leaf.">Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf.</a> Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).</li><li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).</li><li>Eskes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance.">Resistance.</a> Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).</li><li>Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+aspects+of+the+plant-rust+fungus+interface+during+the+compatible+interaction+Coffea+arabica+(cv.+Caturra)-Hemileia+vastatrix+(race+III).">Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III).</a> International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).</li><li>Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+of+infection+and+colonization+of+Pseudocercospora+kaki+in+persimmon+leaves.">Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves.</a> Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).</li><li>Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+plant+samples:+how+to+process+for+GMA+embedding.">Large plant samples: how to process for GMA embedding.</a> Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+staining+technique+for+fungal-infected+plant+tissues.">New staining technique for fungal-infected plant tissues.</a> Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).</li><li>Schuller, A., Ludwig-M&#252;ller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+methods+to+detect+the+clubroot+pathogen+Plasmodiophora+brassicae+during+its+complex+life+cycle.">Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle.</a> Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).</li><li>Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+evidence+of+concomitant+sexual+and+asexual+reproduction+of+Elsino&#235;+ampelina+in+grapevine+under+subtropical+climate.">Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsino&#235; ampelina in grapevine under subtropical climate.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).</li><li>Chesters, C. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+methods+of+using+cotton+blue+as+a+mycological+stain.">Three methods of using cotton blue as a mycological stain.</a> Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).</li><li>Macedo, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+of+Techniques+in+Plant+Histology.">Manual of Techniques in Plant Histology.</a> Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).</li><li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts.">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).</li><li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+in+wool+dyeing.">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).</li><li>Chamberlain, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Plant Histology. , 349 (1932).</li><li>Sterling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal-structure+of+ruthenium+red+and+stereochemistry+of+its+pectin+stain.">Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain.</a> American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).</li><li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruthenium+red+and+violet.+1.+Chemistry,+purification,+methods+of+use+for+electron+microscopy+and+mechanism+of+action.">Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action.</a> The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).</li><li>Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Wall.">Cell Wall.</a> Plant Physiology. , 165-181 (2013).</li></ol>

Föreliggande arbete introducerar ett alternativt dubbelfärgnings histokemiskt test för att undersöka pektinsammansättningen av cellväggar som kapslar in haustoria i ett biotrofiskt patosystem. Syftet är också att demonstrera metodens effektivitet för att detektera nekrotrofisk svamp och cellväggsförändringar inducerade av den. Här kan pektin av kaffeparenkymcellväggar kapsla in både halsen och haustoriumet hos rostsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har också beskrivit inkapsling av cellulos...

Cellväggsförsvarsmekanismer i växter är avgörande för att begränsa svampinfektion. Studier har rapporterat förändringar i cellväggens tjocklek och sammansättning sedan 1800-talet 1,2. Dessa förändringar kan induceras av en svamppatogen som stimulerar bildandet av en papilla, vilket förhindrar att svampar kommer in i cellen eller kan användas för att kapsla in hyferna för att isolera värdcellens protoplast från svamp haustoria. Produktionen av en dynamisk cellväggsbarriär (dvs. papiller och ett helt inneslutet haustorium) är viktigt för att främja växtresistens3. Histopatologiska studier på svamprelaterade sjukdomar har undersökt förekomsten av dessa mekanismer och har beskrivit cellväggspolymererna, cellulosa, hemicellulosa (arabinoxylaner) och callos som resistensmekanismer mot svampangrepp 4,5,6,7.
Cellväggen är den första barriären mot mikroorganismangrepp, vilket försämrar interaktionen mellan växt och svamp. Pektiska polysackarider komponerar cellväggen och står för cirka 30% av cellväggskompositionen i primära celler av eudikotväxter där homogalakturonaner är den vanligaste polymeren (ungefär 60%)8. Golgi utsöndrar komplexa pektinföreningar som utgör galakturonsyrakedjorna, som kan eller inte kan metyleras 8,9. Sedan 2012 har litteraturen påpekat att graden av pektinmetylförestring är avgörande för att bestämma kompatibiliteten under infektion med mikrobiella pektiska enzymer 10,11,12. Således krävs protokoll för att verifiera närvaron och fördelningen av pektiska föreningar i växtsvamppatosystem.
Olika tekniker har använts för att detektera inkapsling av papiller eller haustoria. Referensmetoderna som används är transmissionselektronmikroskopi (TEM) av fast vävnad och ljusmikroskopi av levande och fasta vävnader. När det gäller TEM har flera studier visat den strukturella rollen av cellväggsappositioner i svampresistens 13,14,15,16, och att användningen av lektiner och antikroppar är en invecklad metod för att lokalisera kolhydratpolymerer 16. Studier visar dock att ljusmikroskopi är ett viktigt tillvägagångssätt och att de histokemiska och immunohistokemiska verktygen möjliggör en bättre förståelse av sammansättningen av papiller och haustoriumhölje 6,7.
Patogena svampar visar två huvudtyper av livsstilar: biotrofisk och nekrotrofisk. Biotrofa svampar är beroende av levande celler för sin näring medan nekrotrofa svampar dödar värdcellerna och lever sedan i de döda vävnaderna17. I Latinamerika är kaffebladrost, orsakad av svampen Hemileia vastatrix, en viktig sjukdom i kaffegrödor18,19. Hemileia vastatrix uppvisar ett biotrofiskt beteende och bland de strukturella förändringar som observerats hos resistenta kaffearter eller sorter har ett överkänslighetssvar, avsättning av callos, cellulosa och lignin på cellväggarna samt cellhypertrofi14 rapporterats. Såvitt författarna vet rapporterar litteraturen inte information om pektins betydelse för kafferostmotstånd. Å andra sidan riktar sig nekrotrofa svampar som orsakar cercosporios pektin via en uppsättning enzymer associerade med cellväggsnedbrytning, såsom pektinaser och polygalakturonas20. Cercosporiosis i kaffe, orsakad av svampen Cercospora coffeicola är också ett stort hot mot kaffegrödor21,22. Denna svamp orsakar nekrotiska lesioner i både löv och bär. Efter penetration koloniserar C. coffeicola växtvävnader genom intracellulära och intercellulära vägar 23,24,25.
Det nuvarande protokollet undersöker förekomsten av svampstrukturer och pektin på cellväggar. Detta protokoll är användbart för att identifiera växtresponsen associerad med pektin (färgad med ruteniumrött färgämne, vilket är specifikt för sura grupper av polyuroniska syror av pektin), inducerat av värden i en biotrofisk interaktion med svamp. Det hjälper också till att verifiera effekten av nekrotrofa svampar på nedbrytningen av pektiska cellväggar. De nuvarande resultaten indikerar att dubbelfärgningsmetoden är effektiv för att diskriminera strukturer och reproduktionsfasen hos svampar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blades DB80 HS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838383</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EMS</td>
			<td># 11652</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Blue Lactophenol</td>
			<td>Metaqu&#237;mica</td>
			<td>70SOLSIG024629</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15712</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#16216</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Historesin Kit</td>
			<td>Technovit /EMS</td>
			<td>#14653</td>
			<td>Historesin for embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Dubesser</td>
			<td>SSCD25X30-110V</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#490040-0030-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome (Leica RM 2540)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>149BIO000C1 14050238005</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic molding cup tray</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10176-30</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruthenium red</td>
			<td>LABHouse</td>
			<td>#006004</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axion Vision</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#410130-0909-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Prismatec</td>
			<td>131 TIPO 2 V.C.</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction

Växtceller använder olika strukturella mekanismer, antingen konstitutiva eller inducerbara, för att försvara sig mot svampinfektion. Inkapsling är en effektiv inducerbar mekanism för att isolera svamp haustoria från växtcellens protoplast. Omvänt är pektin, en av de polymera komponenterna i cellväggen, ett mål för flera pektolytiska enzymer i nekrotrofa interaktioner. Här presenteras ett protokoll för att detektera pektin och svamphyfer genom optisk mikroskopi. Den pektinrika inkapslingen i cellerna i kaffeblad infekterade av rostsvampen Hemileia vastatrix och mesofyllcellväggsmodifieringen inducerad av Cercospora coffeicola undersöks. Lesionerade bladprover fixerades med Karnovsky-lösningen, uttorkades och inbäddades i glykolmetakrylat i 2-4 dagar. Alla steg följdes av vakuumpumpning för att avlägsna luft i de intercellulära utrymmena och förbättra inbäddningsprocessen. De inbäddade blocken sektionerades i 5-7 μm tjocka sektioner, som deponerades på en glasrutschbana täckt med vatten och därefter upphettades till 40 ° C i 30 minuter. Därefter dubbelfärgades bilderna med 5% bomullsblå i laktofenol för att detektera svampen och 0,05% ruteniumrött i vatten för att detektera pektin (sura grupper av polyuroniska syror av pektin). Svamp haustoria av Hemileia vastatrix befanns vara inkapslad av pektin. Vid kaffecercosporios uppvisade mesofyllceller upplösning av cellväggar och intercellulära hyfer och konidioforer observerades. Metoden som presenteras här är effektiv för att detektera ett pektinassocierat svar i interaktionen mellan växter och svampar.

Den bomullsblå laktofenolfärgningen på den GMA-inbäddade sektionen avslöjade närvaron av flera svampstrukturer mellan och inuti kaffemesofyllceller i både biotrofa och nekrotrofa svampinteraktioner.
I det biotrofa patosystemet, när det färgas med dubbelfärgningsmetoden, uppträder Hemileia vastatrix hyfer innehållande cellväggar och det täta protoplastinnehållet i mörkblått i både svampigt och palisadparenkym (figur 4A,B)...

Watch this Scientific Journal Video about Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction at JoVE.com

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Detta protokoll beskriver en mikroskopisk metod för att detektera pektin i kaffe-svampinteraktion.

Dubbelfärgningsmetod för att detektera pektin i interaktion mellan växter och svampar

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det gör det möjligt att identifiera interaktionen mellan växt och svamp. Förutom att färga pektinet visar det också defekter på patogencellväggpolymeren och möjliggör identifiering av svampstrukturer. Denna enkla och okomplicerade teknik kan utföras med ljusmikroskopi och det kräver ingen dyr utrustning som svepelektronmikroskop.Dessutom är det en snabb teknik som får en utmärkt distinktion av växtstrukturer för histopatologiska studier. Tekniken identifierar interaktionen mellan växt och svamp. Därför samarbetar den för att diagnostisera de sjukdomar som orsakas av biotrofa och nekrotrofa svampar som kafferost och cercosporios.Till att börja med, skörda och cirka 10 kvadratmillimeter bladprov vid mitten av lesionen med en skalpell och pincett och fördjupa den i 30 ml Karnovsky fixativ lösning. Utsätt bladprovet för ett lågt vakuum på 500 till 600 millibar i 15 minuter med hjälp av en oljepump, minst fyra gånger för att öka permeabiliteten hos den fixerande lösningen i bladvävnaden. Efter fixering, tvätta bladprovet tre gånger i 0,5 M kacodylatbuffert utspädd i destillerat vatten i fem minuter vardera och överför det sedan till en graderad etanolserie i 15 minuter vid varje etanolkoncentration.För att gradvis överföra proverna till glykolmetakrylat, gör lösning A genom att blanda ett gram glykolmetakrylatpulver med 100 ml basiskt harts under magnetisk omrörning. Sänk sedan ner proverna i förhållande ett till två av lösning A och 100% etanol i tre timmar. Sänk ner proverna i förhållandet ett till ett för lösning A: 100% etanol i tre timmar, nedsänkt sedan i ett rent basharts i två till fyra dagar.Utsätt provet för ett lågt vakuum minst fyra gånger om dagen i 15 minuter, följt av rotation. Blanda 15 ml lösning A med en milliliter härdare i en bägare med rotation i två minuter för att producera polymerisationslösningen B.Sätt 1,2 ml av denna polymerisationslösning B i plastformar. Använd en träplockning, överför de lesionerade bladproverna från rent basharts till lösning B och undvik att använda pincett eftersom de kan orsaka vävnadskrossning.Se till att snabbt orientera bladprover vinkelrätt mot plastformarna eftersom lösning B snabbt blir trögflytande. När den vinkelräta orienteringen av bladproverna uppnås, vänta i 30 minuter och överför sedan plastformen till en plast- eller glaskammare som innehåller kiselgel för att förhindra fuktighet. När hartset och bladprovet polymeriserats efter två till tre timmar, lossa det resulterande blocket från plastformen genom att slipa blockbasen med en slipfil.Limma sedan blocket på en bit trä. Skär blocket i fem mikrometer tjocka sektioner med en roterande mikrotom utrustad med åtta centimeter stålblad. Placera sektionerna på glasrutschbanor täckta med destillerat vatten.Överför sedan bilderna till en kokplatta för att torka vid 40 grader Celsius och främja vidhäftningen av sektionerna till glasglasen. Efter torkning, märk glasbilderna med blockets referensnamn och glidnummer. Täck sektionerna med två milliliter 5% bomullsblå i laktofenol och värm dem på en kokplatta vid 45 grader Celsius i fem minuter.Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta bilden tre gånger i en bägare fylld med destillerat vatten. Fläcka den med två milliliter 0,01%ruteniumröd i vatten i en minut. Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta bilden tre gånger i en bägare fylld med destillerat vatten.Lägg en droppe destillerat vatten över sektionerna och täck sektionerna med en täckslip för att utföra ljusmikroskopianalys. I dubbelfärgningsmetoden uppträdde Hemileia vastatrix hyfer innehållande cellväggar och det täta protoplastinnehållet mörkblått i både svampigt och palisadparenkym. Haustoriummodercellen och haustoria uppvisade också en mörkblå färg.Räknarfärgningen med ruteniumröd tydligt definierad svampfördelning i de intercellulära utrymmena. Under interaktionen bröt Hemileia vastatrix haustorium modercell värdcellväggen och utvecklade en haustoriell hals omgiven av pektiska föreningar. Den pektinrika rosa-rödfärgade inkapslingen av haustorialhalsen kan inte förhindra haustoriell bildning.I vissa fall inneslöt den pektinrika inkapslingen haustoriumet ofullständigt. Och i vissa fall är haustorium helt inkapslat. Den pektinrika cellväggen upprätthåller integriteten vid lesionsgränsen, där svampen inte är närvarande.Den dubbla färgningsmetoden visade närvaron av intercellulära hyfer. I interaktionszoner tycktes pektincellväggar förlora sin integritet på grund av upplösning. Reproduktiva strukturer som konidier hittades i adaxial epidermis.Cercospora coffeicola hyfer hittades i den substomatiska kammaren som curlingstrukturer, och palisadparenkymen i lesionsområdet verkar genomgå cellväggslys. Undvik att använda pincett eftersom de kan orsaka vävnadskrossning. Ytterligare histopatologiska studier på rost, antracnos, cercosporios, smuts och andra biotrofa, hemibiotrofa och nekrotrofa växt-svampinteraktioner bör genomföras för att undersöka den potentiella användningen av denna teknik i olika patosystem.

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay-analys: Ett protokoll till Test Interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Användning av LysoTracker att upptäcka programmerad celldöd i embryon och Skilja embryonala stamceller

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Använda Coculture att upptäcka Kemiskt medierade mellan arter Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analys av apoptos i Zebrafish embryon genom Hela montering Immunofluorescence att upptäcka Aktiverad Caspas 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...