Name: a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

يعترف المؤلفون بدعم منحة أبحاث البنية التحتية من مؤسسة العلوم الأيرلندية (SFI) (16/RI/3745) إلى JCS. يتم دعم العمل في مختبر فحص الخلايا UCD من قبل كلية UCD للعلوم. يتم تمويل ASC من قبل منحة الدراسات العليا التابعة لمجلس البحوث الأيرلندي (IRC) التابع لحكومة أيرلندا (GOIPG/2019/68). كما يشكر المؤلفون جميع أعضاء المختبر على مدخلاتهم ومناقشاتهم المفيدة. تم إنشاء العمل الفني في الشكل 1 في BioRender.

1. زراعة الخلايا
<ol><li>إعداد وسائل الإعلام<ol>
<li>قم بإعداد وسائط زراعة خلايا محددة اعتمادا على نوع خط الخلية. تأكد من أن جميع الوسائط لصيانة الخلايا تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). ملاحظة: تستخدم خطوط الخلايا المختلفة وسائط مختلفة. تزرع خلايا سرطان القولون HT-29 (ATCC HTB-38) في McCoys 5A + 10٪ FBS...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+models:+state+of+the+art+and+their+application+for+hepatotoxicity+evaluation.">Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation.</a> Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+and+pharmacological+applications+of+three-dimensional+cancer+cell+cultures+and+organoids.">Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids.</a> Life Sciences. 254, 117784 (2020).</li><li>Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+3D+tissue+models+and+their+compatibility+with+live-cell+imaging.">Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).</li><li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+gold+nanorods'+interaction+with+large+3D+pancreatic-stromal+tumor+spheroids+by+multimodal+imaging:+Fluorescence,+photoacoustic,+and+photothermal+microscopies.">Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-based+high-content+screening.">Microscopy-based high-content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mysior, M. M., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell3:+A+new+vision+for+study+of+the+endomembrane+system+in+mammalian+cells.">Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells.</a> Bioscience Reports. , (2021).</li><li>N&#252;rnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures:+Simplicity+forward.">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).</li><li>Cutrona, M. B., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-throughput+automated+confocal+microscopy+platform+for+quantitative+phenotyping+of+nanoparticle+uptake+and+transport+in+spheroids.">A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids.</a> Small. 15 (37), 1902033 (2019).</li><li>Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids.">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+mesenchymal+stem+cell+3D+spheroids+using+low-binding+plates.">Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates.</a> Bio-protocol. 8 (16), (2018).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes.">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).</li><li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations.">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li><li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids.">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904 (2020).</li><li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants+(PDEs)+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery.">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li><li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants,+xenografts+and+organoids:+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer.">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li><li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants.">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li></ol>

يفصل النهج الموصوف هنا منصة لتوليد عدة مئات من الكرويات لكل بئر بطريقة مناسبة ل HCS و HCA. بالمقارنة مع الطرق الشائعة الأخرى ، مثل استخدام لوحات ULA ذات القاع المسطح والدائري القاع ، والتي تسمح بتكوين كروي واحد فقط لكل بئر18,19 ، توفر هذه الطريقة الفرصة لاستخراج مع...

تقليديا ، تم إجراء الفحوصات القائمة على الخلايا في طبقات أحادية تنمو على ركيزة صلبة ، والتي يمكن اعتبارها بشكل فعال بيئة ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، أصبح من المعترف به بشكل متزايد أن نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد تفتقر إلى الأهمية الفسيولوجية في بعض السياقات ولا يمكنها تكرار العديد من التفاعلات المعقدة التي تحدث بين الخلايا 1. أصبحت طرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) شائعة بسرعة بين الباحثين ، وتظهر نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد إمكانات عالية لمحاكاة الظروف الفسيولوجية التي تواجهها الخلايا في بيئة الأنسجة بشكل أفضل2. هناك عدة أنواع مختلفة من تجمعات الخلايا 3D التي تم استخدامها ، ولكن النوعين الأكثر شيوعا هما الكرويات والعضوية. يمكن زراعة الكرويات من العديد من خطوط الخلايا المختلفة، ويمكنها اعتماد أشكال وأحجام مختلفة اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة وطريقة تجميعها3. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا الإشارة إلى الكرويات باسم الكرويات متعددة الخلايا (MCTS) عندما تزرع من خطوط الخلايا السرطانية ، وقد وجدت هذه النماذج استخداما خاصا لتوصيل الأدوية قبل السريرية في المختبر ودراسات السمية4,5. من ناحية أخرى ، تهدف المواد العضوية إلى محاكاة الأنسجة والأعضاء في أجسامنا بشكل أفضل ويمكن أن تعتمد ترتيبات مورفولوجية أكثر تعقيدا. ينطوي إنتاج المواد العضوية على استخدام الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والتي يمكن إعادة برمجتها في الخلايا المناسبة لتشبه الأنسجة أو الأعضاء ذات الاهتمام. وهي تستخدم في المقام الأول للتحقيق في تطور الأعضاء ونمذجة الأمراض والتفاعلات بين المضيف والممرضات6.
هناك مجموعة من الطرق المختلفة المستخدمة لإنشاء تجميعات خلايا 3D. توفر الطرق القائمة على السقالات ركيزة أو دعما يمكن للخلايا أن تلتصق به أو تنمو داخله. يمكن أن يكون لهذه السقالات أشكال مختلفة ويمكن تصنيعها من مجموعة متنوعة من المواد المختلفة. الأكثر شيوعا هي مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والمواد الهلامية المائية ، وهي مصممة لتشبه البيئة الطبيعية خارج الخلية للخلايا وبالتالي تسهيل التفاعلات الفسيولوجية4,7. تم استخراج مادة الطابق السفلي ECM من ورم ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm وتبين أنها تحتوي على مزيج غني من مكونات ECM ، بما في ذلك laminin والكولاجين من النوع الرابع و perlecan8. ومع ذلك ، على الرغم من تكوينه المفيد ، هناك تحديان رئيسيان في استخدامه ، وهما تقلبه من دفعة إلى أخرى وأن لديه حالتين مختلفتين من المجموع أقل وفوق 10 درجات مئوية 8,9. في المقابل ، تتمتع الهيدروجيل بميزة المرونة فيما يتعلق بمكوناتها وصلابتها ، ويمكن تخصيصها لتناسب مجموعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المحددة المطلوبة7,10. الطرق القائمة على السقالات ضرورية للنمو العضوي ولكنها تستخدم أيضا على نطاق واسع للكرويات. عادة ما تكون الطرق الخالية من السقالات ، والتي تعمل عن طريق منع الخلايا من الالتصاق بالسطح الذي تنمو عليه ، متوافقة فقط مع التجميع الكروي. ومن الأمثلة على ذلك لوحات التعلق المنخفضة للغاية (ULA) ، إما مع قاع مسطح أو قاع U ، مما يسمح بتجميع الخلايا في كرويات ، أو استخدام التحريض المستمر للخلايا في قوارير الدوران / الدوران 10.
استخدام جمعيات الخلايا 3D لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث البيولوجية يكتسب شعبية بسرعة. ومع ذلك ، من الضروري أن تكون الطريقة المختارة لثقافتهم مناسبة ومتوافقة مع خطط تحليلهم النهائي. على سبيل المثال ، يولد استخدام لوحات ULA كرويات ذات اتساق عال. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطريقة على إنتاج كروي واحد لكل بئر ، مما يحد من الإنتاجية. هناك حاجة إلى اعتبار خاص عند التخطيط للتصوير الفلوري لهيكل 3D. يجب أن تكون الركيزة أو اللوحة التي تزرع عليها المجموعة متوافقة بصريا ، ويجب توخي الحذر لتقليل آثار تشتت الضوء الناجم عن أي سقالات قد تكون استخدمت 11. تصبح هذه المشكلة بالذات أكثر حدة مع زيادة الفتحة العددية للعدسات الموضوعية المجهرية.
يمكن القول إن أحد الأسباب الرئيسية لاختيار العمل مع نموذج خلية 3D هو استخراج بيانات التصوير الحجمي ليس فقط حول التجميع بأكمله ولكن أيضا الخلايا الفردية داخله. بدأت نماذج MCTS ، على وجه الخصوص ، تثبت قوتها الكبيرة لتعميق فهمنا لكيفية انتقال العلاجات من الخارج إلى الخلايا المركزية (كما تحتاج إلى ذلك في الورم)12 ، وبالتالي فإن اكتساب المعرفة من الخلايا الفردية في طبقات مختلفة أمر ضروري. تسمى تقنية التصوير التي تستخرج المعلومات الكمية من الخلايا الفردية تحليل المحتوى العالي (HCA) وهي نهج قوي في سياق الفحص13. حتى الآن ، تم تطبيق HCA بشكل حصري تقريبا على ثقافات الطبقة الأحادية ، ولكن هناك إدراك متزايد بأن هذا النهج لديه القدرة على تطبيقه على ثقافات 3D مما يتيح دراسة مجموعة واسعة من الوظائف والعمليات الخلوية14. سيكون لها ميزة واضحة أنه يمكن تحليل أعداد كبيرة من التجميعات 3D ، مما قد يوفر بيانات على مستوى الخلية من جميع أنحاء كل هيكل. ومع ذلك ، يجب التغلب على التحديات المرتبطة بتصوير مجموعات الخلايا التي يحتمل أن تكون سميكة ، وكذلك مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها.
في هذه المقالة ، يتم تقديم طريقة قوية قائمة على السقالات لإنتاج MCTS على نطاق واسع بتنسيق 96 بئرا. تسهل هذه الطريقة إنتاج عدة مئات من تجميعات الخلايا 3D في كل بئر. يتم عرض أمثلة لثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا ، تمثل نماذج الورم الصلب للكبد والرئة والقولون. يمكن أن تكون الكرويات التي تتشكل من مجموعة متنوعة من الأحجام ، وبالتالي يتم استخدام HCA لاختيار هياكل ذات حجم و / أو مورفولوجيا معينة. توفر هذه الميزة ميزة إضافية تتمثل في إمكانية مقارنة أي أنماط ظاهرية لوحظت عبر كرويات ذات أحجام مختلفة ، ولكن جميعها تعامل بنفس الطريقة في نفس البئر. يتوافق هذا النهج مع التصوير عالي الدقة ، والأهم من ذلك توفير بيانات كمية على مستوى الخلية وتحت الخلية من نفس التجميعات الخلوية. وتتمتع طريقة الإنتاج الكروي هذه بميزة إضافية على الطرق التي تولد كروية واحدة لكل بئر، وأن الأعداد الكبيرة من الكرويات المنتجة في كل بئر يحتمل أن توفر كتلة حيوية كافية للتحليلات النهائية الأخرى، مثل التنميط النسخي والبروتيني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10050070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>These plates have been renamed as Phenoplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10647032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>10358633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H4A3-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HCSHH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup sterile vacuum filter units</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications

الفحص عالي المحتوى (HCS) والتحليل عالي المحتوى (HCA) هما تقنيتان توفران للباحثين القدرة على استخراج قياسات النمط الظاهري الكمي واسعة النطاق من الخلايا. وقد أثبت هذا النهج قوته في تعميق فهمنا لمجموعة واسعة من الأحداث الأساسية والتطبيقية في بيولوجيا الخلية. حتى الآن ، اعتمدت غالبية تطبيقات هذه التكنولوجيا على استخدام الخلايا المزروعة في الطبقات الأحادية ، على الرغم من أنه من المعلوم بشكل متزايد أن هذه النماذج لا تلخص العديد من التفاعلات والعمليات التي تحدث في الأنسجة. على هذا النحو ، كان هناك ظهور في تطوير واستخدام جمعيات الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) ، مثل الكرويات والمواد العضوية. على الرغم من أن هذه النماذج 3D قوية بشكل خاص في سياق بيولوجيا السرطان ودراسات تسليم الأدوية ، إلا أن إنتاجها وتحليلها بطريقة قابلة للتكرار مناسبة ل HCS و HCA يمثل عددا من التحديات. يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة لتوليد الكرويات متعددة الخلايا (MCTS) ، ويوضح أنه يمكن تطبيقها على ثلاثة خطوط خلايا مختلفة بطريقة متوافقة مع HCS و HCA. وتسهل هذه الطريقة إنتاج عدة مئات من الكرويات لكل بئر، مما يوفر ميزة محددة تتمثل في أنه عند استخدامها في نظام الفحص، يمكن الحصول على البيانات من عدة مئات من الهياكل لكل بئر، ومعالجتها جميعا بطريقة متطابقة. كما يتم تقديم أمثلة توضح بالتفصيل كيفية معالجة الكرويات للتصوير الفلوري عالي الدقة وكيف يمكن ل HCA استخراج الميزات الكمية على كل من المستوى الكروي وكذلك من الخلايا الفردية داخل كل كروية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهولة للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة المهمة في بيولوجيا الخلية.

في هذا البروتوكول ، يتم تفصيل طريقة قوية لإنتاج تجمعات زراعة الخلايا 3D في شكل كرويات ، باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا لتمثيل أنسجة الورم المختلفة. تسمح هذه الطريقة بتوليد مئات الكرويات لكل بئر ، مما يتيح إجراء الفحوصات القائمة على الخلايا بطريقة عالية المحتوى (الشكل 1). و...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

يفصل هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات بطريقة تجعلها مناسبة للفحص والتحليل عالي المحتوى على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم أمثلة توضح كيف يمكن تحليلها على مستويات الخلايا الكروية والفردية.

طريقة قوية لإنتاج الكرويات على نطاق واسع لتطبيقات الفحص والتحليل عالية المحتوى

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة لإنتاج عدة مئات من الكرويات السرطانية متعددة الخلايا في كل بئر من صفيحة بئر متعددة مناسبة للفحص المجهري الآلي. يمكن تصنيف الكروية المنتجة إلى فئات مختلفة الحجم ، ويمكن استخراج المعلومات دون الخلوية من كل خلية. تنتج هذه التقنية أمصال كافية يمكن استخدامها في الفحص المباشر ودراسات تداخل الحمض النووي الريبي.قم بتخفيف مادة الطابق السفلي ECM في وسط خال من المصل الأحمر البارد باستخدام أطراف مبردة مسبقا محفوظة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أراهن على 15 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM والحل المتوسط في لوحة تصوير 96 بئرا. قم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة 20 دقيقة بسرعة 91 مرة G عند أربع درجات مئوية.احتضن الطبق لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف رحلات و EDTA إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نهاية الحضانة ، نقوم بتعليق الخلايا في وسط كامل يحتوي على 10٪ FBS.ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، في غرفة عد مقياس الدم. احسب عدد الخلايا في أربعة أرباع الغرفة. ينظر سنترا إلى الخلايا عند 135 مرة G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.واحدة من هذه الخلايا يتم تكويرها ، وشفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر للحصول على تركيز 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. تمييع الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر. انظر الخلايا بقطرة في حركة دائرية بحجم إجمالي قدره 35 ميكرولتر لكل بئر.احتضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عند 1.2 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM إلى 23.8 ميكرولتر من الفينول الأحمر الخالي من الوسط الكامل لكل بئر ، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره 60 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الخالي من الفينول الأحمر الطازج. أدخل صفيحة البئر 96 التي تحتوي على كرويات في مجهر فحص عالي المحتوى متحد البؤرة. حدد أشعة الليزر المناسبة لإثارة الأرضيات المستخدمة.احصل على القنوات بالتتابع لتجنب الحديث المتبادل ، وصور الكرويات باستخدام الأهداف المناسبة. لتحليل مورفولوجيا الكرويات ، قم بتقسيم الكرويات بناء على FLoid المترافق مع الفلورسنت والتلطيخ. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ.قسم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين ، وصمة عار موجودة في سيتوبلازم الخلية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للكرويات بما في ذلك الحجم ومساحة السطح والكروية وعدد النوى لكل كرويات. لدى روس صور إضافية لإزالة الكرويات الأصغر من 75 ميكرومتر مكعب وأكبر من 900،000 ميكرومتر مكعب.لتحليل خلية واحدة داخل الكرويات، قم بتقسيم الكرويات بناء على تلطيخ كروي مترافق مع الفلورسنت. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. قم بتقسيم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، وصمتين موجودتين في سيتوبلازم الخلية.قسم الليزوسومات على أساس تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للخلايا داخل كل كروية، بما في ذلك عدد الليزوسومات لكل خلية وحجم الخلية ومساحة سطح الخلية. يوضح الشكل لمحات عامة جيدة عن ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات ، بما في ذلك الصور في مستويات مختلفة متحدة البؤرة.كما يتم عرض منظر حجمي للكرويات بأكملها. يوضح الشكل عملية تجزئة الأس الهيدروجيني ، وتعرض اللوحة A الكرويات بأكملها في عرض حجمي. تعرض اللوحة B التقسيم المحدد للسيتوبلازم والنوى والليزوسومات داخل جميع خلايا كروية واحدة.يتم تقسيم السيتوبلازم والنوى على أساس سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. ويتم تقسيم الليزوسومات بناء على تلطيخ الأجسام المضادة للمختبر المضاد واحد. تعرض اللوحات C نفس المقطع مثل اللوحة B، ولكن في عرض عادي ثلاثي.يمكن إجراء قياسات مورفولوجية مختلفة على مستوى الكرويات. وتشمل هذه القياسات حساب عدد النوى لكل كروية، فضلا عن هذه السعادة والحجم ومساحة سطح الرقم الهيدروجيني. الحجم النموذجي لكل خلية في الأنواع الكروية الثلاثة.وكذلك عدد الليزوسومات لكل خلية موضحة في هذا الشكل. يعد تحسين كثافة المقاعد الأولية للخلايا في بداية جيل SP خطوة حاسمة. يوضح الشكل أن إضافة عدد كبير جدا من الخلايا لا يزال يسمح بتكوين الكرويات.ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى الانصهار إذا كانت كروية. يمكن أن تخضع الكرويات التي تنتج بهذه الطريقة للتحليل النسخي والبروتيني. تستخدم هذه التقنية للتحليل الكمي لامتصاص توصيل الأدوية مثل هذه الجسيمات النانوية وتقييم سميتها للخلايا الفردية في الكرويات.

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...