Name: a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.

1. תרבות התא
<ol><li>הכנת מדיה<ol>
<li>הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS). הערה: שורות תאים שונות משתמשות במדיה שונה. תאי קרצינומה במעי הגס HT-29 (ATCC HTB-38) גדלים ב- McCoys 5A + 10% FBS. תאי קרצינומה hepG2 hepatocellular (ATCC HB-8065) גדלים במדיום חיוני...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+models:+state+of+the+art+and+their+application+for+hepatotoxicity+evaluation.">Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation.</a> Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+and+pharmacological+applications+of+three-dimensional+cancer+cell+cultures+and+organoids.">Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids.</a> Life Sciences. 254, 117784 (2020).</li><li>Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+3D+tissue+models+and+their+compatibility+with+live-cell+imaging.">Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).</li><li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+gold+nanorods'+interaction+with+large+3D+pancreatic-stromal+tumor+spheroids+by+multimodal+imaging:+Fluorescence,+photoacoustic,+and+photothermal+microscopies.">Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-based+high-content+screening.">Microscopy-based high-content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mysior, M. M., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell3:+A+new+vision+for+study+of+the+endomembrane+system+in+mammalian+cells.">Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells.</a> Bioscience Reports. , (2021).</li><li>N&#252;rnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures:+Simplicity+forward.">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).</li><li>Cutrona, M. B., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-throughput+automated+confocal+microscopy+platform+for+quantitative+phenotyping+of+nanoparticle+uptake+and+transport+in+spheroids.">A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids.</a> Small. 15 (37), 1902033 (2019).</li><li>Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids.">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+mesenchymal+stem+cell+3D+spheroids+using+low-binding+plates.">Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates.</a> Bio-protocol. 8 (16), (2018).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes.">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).</li><li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations.">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li><li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids.">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904 (2020).</li><li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants+(PDEs)+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery.">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li><li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants,+xenografts+and+organoids:+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer.">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li><li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants.">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li></ol>

הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה...

באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים רבים ושונים, והם יכולים לאמץ צורות וגדלים שונים בהתאם לסוג התא המשמש ולשיטת ההרכבה שלהם3. יתר על כן, spheroids יכול גם להיקרא spheroids גידול רב תאי (MCTS) כאשר הם גדלים מקווי תאים סרטניים, ומודלים אלה מצאו שימוש מיוחד עבור משלוח תרופות הפריה-קלינית במבחנה ומחקרי רעילות4,5. Organoids, לעומת זאת, שואפים לחקות טוב יותר את הרקמות והאיברים בגוף שלנו והוא יכול לאמץ סידורים מורפולוגיים מורכבים יותר. הייצור של organoids כרוך בשימוש בתאי גזע בוגרים או תאי גזע pluripotent, אשר ניתן לתכנת מחדש לתוך התאים המתאימים כדי להידמות לרקמה או איבר העניין. הם משמשים בעיקר כדי לחקור את התפתחות האיברים וכדי מודל מחלות ואינטראקציות מארח-פתוגן6.
יש מגוון של שיטות שונות המשמשות ליצירת הרכבות תאים תלת-ממדיות. שיטות מבוססות פיגומים מספקות מצע או תמיכה שבהם תאים יכולים להיצמד או לגדול בתוכם. פיגומים אלה יכולים להיות צורות שונות והוא יכול להיעשות ממגוון רחב של חומרים שונים. הנפוצים ביותר הם רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והידרו-ג'לים, והם נועדו להידמות לסביבה החוץ-תאית הטבעית של התאים ובכך להקל על אינטראקציות פיזיולוגיות4,7. חומר מרתף ECM הופק מגידול סרקומה עכבר אנגלברט-הולם-נחיל והוכח שהוא מכיל תערובת עשירה של רכיבי ECM, כולל למינין, קולגן מסוג IV ופרלקן8. עם זאת, למרות הרכב היתרון שלה, ישנם שני אתגרים עיקריים עם השימוש בו, כלומר שונות אצווה לאצווה שלה וכי יש לו שני מצבים מצרפיים שונים מתחת ומעל 10 °C8,9. לעומת זאת, הידרוג'לים יש את היתרון של להיות גמיש ביחס לרכיבים שלהם קשיחות, והם יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים את הרכבה ספציפית 3D התא הרצוי 7,10. שיטות מבוססות פיגומים חיוניות לצמיחת אורגנויד אך משמשות גם באופן נרחב עבור כדוריות. שיטות נטולות פיגומים, הפועלות על ידי מניעת הצמדת תאים לפני השטח שעליהם הם גדלים, תואמות בדרך כלל רק להרכבה כדורית. דוגמאות כוללות לוחות קובץ מצורף אולטרה-נמוך (ULA), עם תחתית שטוחה או U-bottom, המאפשרים צבירה של התאים לתוך spheroids, או שימוש בתסיסה מתמשכת של התאים בבקבוקי ספינר / סיבוב10.
השימוש במכלולי תאים תלת-ממדיים כדי לחקור מגוון רחב של אירועים ביולוגיים צובר במהירות פופולריות; עם זאת, זה חיוני כי השיטה שנבחרה עבור התרבות שלהם מתאימה ותואמת עם התוכניות לניתוח במורד הזרם שלהם. לדוגמה, השימוש בלוחות ULA יוצר כדוריות של עקביות גבוהה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת לייצור של ספרואיד יחיד לבאר, ובכך להגביל את התפוקה. שיקול מסוים נדרש כאשר הדמיית פלואורסצנטיות של המבנה 3D מתוכנן. המצע או הצלחת שעליהם גדל ההרכבה צריכים להיות תואמים אופטית, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את ההשפעות של פיזור אור שנגרם על ידי פיגומים שאולי נעשה בהם שימוש11. בעיה מסוימת זו הופכת חריפה יותר ככל שהצמצם המספרי של עדשות המטרה של המיקרוסקופ עולה.
ניתן לטעון שאחת הסיבות העיקריות לבחירה לעבוד עם מודל תא תלת-ממדי היא לחלץ נתוני הדמיה נפחית לא רק על ההרכבה כולה אלא גם על התאים הבודדים שבתוכה. מודלים של MCTS, בפרט, מתחילים להיות חזקים מאוד להעמקת ההבנה שלנו כיצד טיפוליות עוברות מבחוץ לתאים מרכזיים (כפי שהם יצטרכו בגידול)12, ולכן רכישת ידע מתאים בודדים בשכבות שונות היא חיונית. טכנולוגיית ההדמיה המחלצת מידע כמותי מתאים בודדים נקראת ניתוח תוכן גבוה (HCA) והיא גישה רבת עוצמה בהקשר של סינון13. עד כה, HCA יושם כמעט אך ורק על תרבויות monolayer, אבל יש הבנה הולכת וגוברת כי גישה זו יש את הכוח להיות מיושם על תרבויות 3D המאפשר מגוון רחב של פונקציות ותהליכים הסלולר להיחקר14. זה יהיה היתרון הברור כי מספר גדול של הרכבות 3D ניתן לנתח, פוטנציאל מתן נתונים ברמת התא מכל מבנה. עם זאת, יש להתגבר על אתגרים הקשורים להדמיה של הרכבות תאים עבות פוטנציאליות, כמו גם את ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו.
במאמר זה מוצגת שיטה חזקה המבוססת על פיגומים לייצור בקנה מידה גדול של MCTS בפורמט של 96 בארות. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות מכלולי תאים תלת-ממדיים בכל באר. דוגמאות מוצגות עבור שלושה סוגי תאים שונים, המייצגים מודלים של גידול מוצק של הכבד, הריאות והמעי הגס. הספרואידים הנוצרים יכולים להיות במגוון גדלים, ולכן HCA משמש לבחירת מבנים בגודל ו/או מורפולוגיה מסוימים. תכונה זו מספקת את היתרון הנוסף כי כל פנוטיפים שנצפו ניתן להשוות על פני כדוריות בגדלים שונים, אבל כל מטופלים באותו אופן באותה באר. גישה זו תואמת הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך מספקת נתונים כמותיים ברמת התא והן ברמת התא התת-תאית מאותן מכלולים תאיים. שיטה זו של ייצור כדורי יש יתרון נוסף על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לכל באר, כי המספרים הגדולים של spheroids המיוצר בכל באר פוטנציאל לספק ביומסה מספקת עבור ניתוחים אחרים במורד הזרם, כגון תמלול ופרופיל פרוטאום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10050070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>These plates have been renamed as Phenoplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10647032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>10358633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H4A3-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HCSHH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup sterile vacuum filter units</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications

סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.

בפרוטוקול זה, מפורטת שיטה חזקה לייצור הרכבות תרבית תאים תלת-ממדית בצורה של כדוריות, תוך שימוש בסוגי תאים שונים כדי לייצג רקמות גידול שונות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות כדוריות לבאר, המאפשרת ביצוע בדיקות מבוססות תאים באופן בעל תוכן גבוה (איור 1). גישה זו שימשה בעבר כדי ללמוד ספי...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לייצר כמה מאות כדוריות גידוליות רב-תאיות בכל באר של צלחת רב-באר המתאימה למיקרוסקופיה אוטומטית. ניתן לסווג את הספרואיד המיוצר למחלקות בגדלים שונים, וניתן לחלץ מידע תת-תאי מכל תא. הטכניקה מייצרת סרומים מספיקים שניתן להשתמש בהם במחקרי סינון ישיר והפרעות RNA.מדלל חומר מרתף ECM במדיום אדום פנול קר ללא סום באמצעות טיפים צונן מראש נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס. אני מתערב על 15 מיקרוליטרים של חומר המרתף ECM ופתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף נסיעות ו- EDTA לתאים. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסוף הדגירה, אנו משעים את התאים במדיום שלם המכיל 10% FBS.פיפטה 10 מיקרוליטרים של השעיית התא, לתוך תא ספירת המוציטומטר. ספור את מספר התאים בארבעה רבעים של התא. Centra צופה בתאים ב 135 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.אחד התאים האלה הם גלולה, לשאוף את supernatant מחדש resuspend התאים במדיום מלא אדום פנול כדי להשיג ריכוז של 10 עד שישה תאים למיליליטר. לדלל את התאים במדיום מלא מלא אדום פנול אדום פנול. ראה את התאים טיפה בתנועה מעגלית בנפח כולל של 35 מיקרוליטרים לבאר.לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. ב 1.2 מיקרוליטרים של חומר מרתף ECM ל 23.8 microliters של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 מיקרוליטרים לבאר. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, להחליף את המדיום עם 100 microliters של פנול אדום טרי חינם בינוני מלא. הכנס את צלחת הבאר 96 המכילה כדוריות, למיקרוסקופ סינון תוכן גבוה קונפוקל. בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הרצפות המשמשות.לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע crosstalk, תמונה spheroids באמצעות מטרות מתאימות. כדי לנתח את המורפולוגיה של כדוריות, פלח את הספרואידים המבוססים על פלואורסצנטיות מצומדות FLoid וכתמים. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות.פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, ארבע, שתיים, כתם שנמצא בציטופלסמה התא. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים כולל נפח, שטח פנים, כדוריות ומספר הגרעינים לפי הספרואידים שלו. לרוס יש תמונות נוספות להסרת כדוריות הקטנות מ-75 מיקרומטר מעוקב ומיקרומטר מעוקב גדול מ-900,000 מ"ק.כדי לנתח תא בודד בתוך כדוריות, פלח את הספרואידים בהתבסס על כתמי הספרואידים המצומדים בפלואורסצנטיות. לפזר את הגרעינים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי כישוף שיורית שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתי כתם שנמצא בציטופלסמה התא.פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ושטח הפנים של התא. האיור מציג סקירות טובות של שלושה סוגים שונים של כדוריות, כולל תמונות במישורים קונפוקליים שונים.תצוגה נפחית של כל הספרואידים מוצגת גם היא. האיור מציג את תהליך פילוח ה- pH, לוח A מציג את כל הספרואידים בתצוגת נפח. לוח B מציג את הפילוח שנקבע של הציטופלסמה, הגרעינים והליזוזומים בתוך כל התאים של ספרואידים בודדים.הציטופלסמה והגרעינים מחולקים על סמך הכישוף שלוש, שלוש, שלוש, ארבע, שתיים מכתימות. וליזוזומים מפולחים על סמך הכתמת נוגדן אנטי מעבדה אחת. חלוניות C מציגות את אותו מקטע כמו לוח B, אך בתצוגה של שלושה רגילים.ניתן לבצע מדידות מורפולוגיות שונות ברמת הספרואידים. מדידות אלה כוללות חישוב של מספר הגרעינים לכל ספרואידים, כמו גם אלה פליסיטי, נפח, ושטח הפנים של pH. הנפח הטיפוסי של כל תא בשלושת סוגי הספרואידים.כמו גם את מספר הליזוזומים לכל תא מוצגים באיור זה. מיטוב צפיפות הישיבה ההתחלתית של התא בתחילת דור SP הוא צעד קריטי. האיור מראה כי הוספת תאים רבים מדי עדיין מאפשרת היווצרות כדוריות.עם זאת, זה יכול לגרום היתוך אם spheroids. Spheroids לייצר באופן זה יכול להיות נתון לניתוח תמלול ופרוטאומי. טכניקה זו משמשת לניתוח כמותי של ספיגת משלוח סמים חלקיקי ננו כאלה ולהעריך את הרעילות שלהם לתאים בודדים בספרואידים.

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...