Name: a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
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著者らは、アイルランド科学財団(SFI)(16/RI/3745)からJCSへのインフラ研究助成金の支援を認めている。UCD細胞スクリーニング研究所での研究は、UCD科学大学によって支援されています。ASCは、アイルランド研究評議会(IRC)のアイルランド政府大学院奨学金(GOIPG/2019/68)から資金提供を受けています。著者らはまた、ラボのすべてのメンバーの意見と有益な議論に感謝します。図 1 のアートワークは、BioRender で生成されたものです。

1. 細胞培養
<ol><li>メディアの準備<ol>
<li>細胞株の種類に応じて特定の細胞培養培地を調製する。細胞維持のためのすべての培地に10%の胎児ウシ血清(FBS)が含まれていることを確認してください。 注:異なる細胞株は異なる培地を使用する。HT−29結腸癌細胞(ATCC HTB−38)は、マッコイズ5A+10%FBS中で増殖される。HepG2肝細胞癌細胞(ATCC HB-8065)は、最小必須培地+ 1%L-グルタミン+ 10%FBSで?...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+models:+state+of+the+art+and+their+application+for+hepatotoxicity+evaluation.">Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation.</a> Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+and+pharmacological+applications+of+three-dimensional+cancer+cell+cultures+and+organoids.">Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids.</a> Life Sciences. 254, 117784 (2020).</li><li>Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+3D+tissue+models+and+their+compatibility+with+live-cell+imaging.">Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).</li><li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+gold+nanorods'+interaction+with+large+3D+pancreatic-stromal+tumor+spheroids+by+multimodal+imaging:+Fluorescence,+photoacoustic,+and+photothermal+microscopies.">Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-based+high-content+screening.">Microscopy-based high-content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mysior, M. M., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell3:+A+new+vision+for+study+of+the+endomembrane+system+in+mammalian+cells.">Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells.</a> Bioscience Reports. , (2021).</li><li>N&#252;rnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures:+Simplicity+forward.">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).</li><li>Cutrona, M. B., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-throughput+automated+confocal+microscopy+platform+for+quantitative+phenotyping+of+nanoparticle+uptake+and+transport+in+spheroids.">A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids.</a> Small. 15 (37), 1902033 (2019).</li><li>Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids.">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+mesenchymal+stem+cell+3D+spheroids+using+low-binding+plates.">Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates.</a> Bio-protocol. 8 (16), (2018).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes.">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).</li><li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations.">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li><li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids.">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904 (2020).</li><li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants+(PDEs)+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery.">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li><li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants,+xenografts+and+organoids:+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer.">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li><li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants.">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li></ol>

ここで説明するアプローチは、HCSおよびHCAに適した方法でウェルあたり数百の回転楕円体を生成するためのプラットフォームを詳述する。ウェルあたり1つの回転楕円体のみの形成を可能にする平底および丸底ULAプレートの使用など、他の一般的な方法と比較して18,19、この方法は、スクリーニング形式で多数の回転楕円体から高解像度情報を抽出?...

伝統的に、細胞ベースのアッセイは、固体基質上に成長する単層において行われており、これは効果的に2次元(2D)環境と考えることができる。しかし、2D細胞培養モデルは、いくつかの文脈では生理学的関連性を欠いており、細胞間で起こる複雑な相互作用の多くを再現できないことがますます認識されつつあります1。3次元(3D)細胞培養法は研究者の間で急速に普及しており、3D細胞モデルは、組織環境内の細胞が遭遇する生理学的条件をよりよく模倣する高い可能性を示しています2。採用されている3Dセルアセンブリにはいくつかの異なるタイプがありますが、最も一般的な2つのタイプは回転楕円体とオルガノイドです。スフェロイドは、多くの異なる細胞株から増殖させることができ、使用する細胞型およびそれらの組み立て方法に応じて様々な形状およびサイズを採用することができる3。さらに、スフェロイドは、癌細胞株から増殖させる場合、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)と呼ばれることもあり、これらのモデルは、前臨床のインビトロ薬物送達および毒性研究に特に使用されることを見出している4,5。一方、オルガノイドは、私たちの体の組織や臓器をよりよく模倣することを目指しており、より複雑な形態学的配置を採用することができます。オルガノイドの産生は、成体幹細胞または多能性幹細胞の使用を含み、これは、目的の組織または器官に類似するように適切な細胞に再プログラムされ得る。これらは主に臓器の発達を調査し、疾患や宿主と病原体の相互作用をモデル化するために使用されます6。
3Dセルアセンブリを生成するために使用されるさまざまな方法があります。足場ベースの方法は、細胞が内部で付着または増殖することができる基質または支持体を提供する。これらの足場は、様々な形状を有することができ、様々な異なる材料から作製することができる。最も一般的なのは細胞外マトリックス(ECM)成分とヒドロゲルであり、それらは細胞の自然な細胞外環境に似せ、それによって生理学的相互作用を促進するように設計されています4,7。ECM地下材料は、エンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫腫瘍から抽出され、ラミニン、IV型コラーゲン、およびペルレカン8を含むECM成分の豊富な混合物を含有することが示された。しかしながら、その有利な組成にもかかわらず、その使用には2つの主な課題、すなわちそのバッチ間の変動性および10°C以下および10°C以上の2つの異なる凝集状態を有する8,9がある。対照的に、ヒドロゲルは、その成分および剛性に関して柔軟であるという利点を有し、そしてそれらは、所望の特定の3D細胞集合体に合うようにカスタマイズすることができる7,10。足場ベースの方法は、オルガノイドの成長に不可欠であるが、回転楕円体にも広く使用されている。足場のない方法は、細胞が成長している表面に細胞が付着するのを防ぐことによって機能しますが、通常は回転楕円体アセンブリとのみ互換性があります。例としては、細胞をスフェロイドに凝集させる平底またはU底のいずれかを備えた超低接着(ULA)プレート、またはスピナー/回転フラスコ内の細胞の連続攪拌の使用が含まれます10。
多種多様な生物学的事象を研究するための3D細胞アセンブリの使用は、急速に人気を集めています。しかし、彼らの培養のために選択された方法が適切であり、下流分析の計画と互換性があることが不可欠です。例えば、ULAプレートを使用すると、高い一貫性の回転楕円体が生成されます。しかし、この方法はウェルあたり単一の回転楕円体の生産に制限されているため、スループットが制限されます。3D構造の蛍光イメージングが計画される際には、特に考慮が必要である。アセンブリが成長させる基板またはプレートは光学的に互換性がある必要があり、使用された可能性のある足場によって引き起こされる光散乱の影響を最小限に抑えるように注意する必要があります11。この特定の問題は、顕微鏡対物レンズの開口数が増加するにつれてより深刻になる。
おそらく、3D細胞モデルを使用することを選んだ主な理由の1つは、アセンブリ全体だけでなく、その中の個々のセルに関する体積イメージングデータを抽出することです。特にMCTSモデルは、治療薬が外部から中枢細胞にどのように移行するか(腫瘍内で必要なように)12の理解を深めるために非常に強力であることが証明され始めているため、異なる層の個々の細胞から知識を得ることが不可欠です。個々の細胞から定量的情報を抽出するイメージング技術は、ハイコンテンツ分析(HCA)と呼ばれ、スクリーニングの文脈において強力なアプローチです13。今日まで、HCAはほぼ独占的に単層培養に適用されてきましたが、このアプローチは幅広い細胞機能とプロセスを研究できる3D培養に適用する力を持っているという認識が高まっています14。多数の3Dアセンブリを解析でき、各構造全体からセルレベルのデータを提供できるという明確な利点があります。しかし、潜在的に厚い細胞集合体のイメージングに関連する課題、および生成される大規模なデータセットは、克服する必要があります。
この記事では、96ウェルフォーマットのMCTSの大規模生産のための堅牢な足場ベースの方法を紹介します。この方法は、各ウェルにおける数百の3D細胞集合体の製造を容易にする。3つの異なる細胞型について例を示し、肝臓、肺、および結腸の固形腫瘍モデルを表す。形成される回転楕円体は様々なサイズであり得るので、HCAは特定のサイズおよび/または形態の構造を選択するために使用される。この特徴は、観察された表現型を異なるサイズの回転楕円体間で比較することができるが、すべて同じウェル内で同じ方法で処理されるという追加の利点を提供する。このアプローチは高解像度イメージングと互換性があり、重要なことに、同じ細胞集合体から細胞レベルと細胞下レベルの両方の定量データを提供します。このスフェロイド生産方法は、ウェルごとに単一のスフェロイドを生成する方法よりもさらに利点があり、各ウェルで生産される多数のスフェロイドは、トランスクリプトームやプロテオームプロファイリングなどの他の下流分析に十分なバイオマスを提供する可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10050070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>These plates have been renamed as Phenoplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10647032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>10358633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H4A3-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HCSHH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup sterile vacuum filter units</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications

ハイコンテントスクリーニング(HCS)およびハイコンテント分析(HCA)は、研究者が細胞から大規模な定量的表現型測定値を抽出する能力を提供する技術です。このアプローチは、細胞生物学における基本的な事象と応用事象の両方の幅広い理解を深めるのに強力であることが証明されています。今日まで、この技術の用途の大部分は単層で増殖した細胞の使用に依存してきましたが、そのようなモデルは組織で起こる相互作用やプロセスの多くを再現しないことがますます認識されています。そのため、スフェロイドやオルガノイドなどの3次元(3D)細胞アセンブリの開発と使用に出現しています。これらの3Dモデルは、がん生物学および薬物送達研究の文脈において特に強力であるが、HCSおよびHCAに適した再現可能な方法でのそれらの産生および解析は、多くの課題を提示する。ここで詳述するプロトコールは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)の生成のための方法を記載し、HCSおよびHCAと適合性のある様式で3つの異なる細胞株に適用できることを実証する。この方法は、ウェル当たり数百個のスフェロイドの産生を容易にし、スクリーニングレジームにおいて使用される場合、ウェル当たり数百個の構造からデータを得ることができ、全て同一の方法で処理され得るという特定の利点を提供する。また、高解像度蛍光イメージングのためにスフェロイドを処理する方法や、HCAがスフェロイドレベルと各スフェロイド内の個々の細胞の両方から定量的特徴を抽出する方法を詳述する例も提供されています。このプロトコルは、細胞生物学における幅広い重要な質問に答えるために容易に適用することができます。

このプロトコルでは、さまざまな腫瘍組織を表すために異なる細胞型を使用して、スフェロイドの形態で3D細胞培養アセンブリを作製する堅牢な方法が詳述されている。この方法では、ウェルあたり数百のスフェロイドを生成できるため、細胞ベースのアッセイを高含有量の方法で実行できます(図1)。このアプローチは、HT-29スフェロイド16 におけるナ...

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A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

このプロトコルは、大規模なハイコンテンツスクリーニングおよび分析に適した方法で3つの異なるタイプのスフェロイドを製造する方法を詳述する。さらに、回転楕円体および個々の細胞レベルでそれらをどのように分析できるかを示す例を提示する。

ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

このプロトコルは、自動顕微鏡検査に適したマルチウェルプレートの各ウェルにおいて数百の多細胞腫瘍性スフェロイドを産生する方法を提供する。産生された回転楕円体は、異なるサイズのクラスに分類することができ、細胞内情報をすべての細胞から抽出することができる。この技術は、直接スクリーニングおよびRNA干渉研究に使用できる十分な血清を産生する。ECM地下室の材料を、マイナス20°Cに保たれた予めチルドチップを使用して、冷たいフェノールレッド無血清培地で希釈する。15マイクロリットルのECM地下材料と培地溶液を96ウェルイメージングプレートに賭ける。プレートを摂氏4度で91倍Gで20分間遠心分離する。プレートを摂氏37度で30分以内にインキュベートする。トリップと EDTA をセルに追加します。インキュベーションの終了時に細胞を摂氏37度でインキュベートし、10%FBSを含む完全培地に細胞を懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで、血球計数計数器計数チャンバーに入れた。チャンバーの4象限内の細胞数をカウントする。セントラは、室温で4分間、135倍Gで細胞を見る。この細胞をペレット化して1つ、上清を吸引し、フェノールレッドを含まない完全培地に細胞を再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の濃度を得る。フェノールレッドを含まない完全培地で細胞を希釈する。細胞が1ウェルあたり35マイクロリットルの総容量で円運動で滴下されるのを見てください。細胞を5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内で摂氏37度で1時間インキュベートする。1.2マイクロリットルのECM地下室材料で、ウェル当たり23.8マイクロリットルのフェノールレッドフリー完全培地まで、ウェル当たり60マイクロリットルの最終容量をもたらす。細胞を摂氏37度で、5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内でインキュベートする。翌日、培地を100マイクロリットルの新鮮なフェノールレッドを含まない完全培地と交換する。スフェロイドを含む96ウェルプレートを、共焦点高含有量スクリーニング顕微鏡に挿入する。使用する床を励起するために適切なレーザーを選択します。クロストークを避けるためにチャンネルを順番に取得し、適切な目的を使用して回転楕円体を画像化します。スフェロイドの形態を分析するには、蛍光的に共役したFLoidと染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。各細胞の細胞質を3、3、4、2の残留六角形によってセグメント化し、細胞質内に存在する染色剤とする。体積、表面積、真球度、スフェロイドごとの核の数など、スフェロイドのさまざまな形態学的特性を計算します。ロスはさらに、75立方マイクロメートルより小さく、900,000立方マイクロメートルより大きい回転楕円体を除去する画像を有する。スフェロイド内の単一細胞を分析するには、蛍光共役スフェロイド染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。細胞質に存在する残留六角形の3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色によって各細胞の細胞質をセグメント化する。二次抗体染色に基づいてリソソームをセグメント化する。細胞あたりのリソソームの数、細胞体積および細胞表面積を含む、各スフェロイド内の細胞の異なる形態学的特性を計算する。この図は、異なる共焦点面での画像を含む、3つの異なるタイプの回転楕円体の概要をよく示しています。回転楕円体全体の体積図も表示されます。図はpHセグメンテーションプロセスを示し、パネルAは体積図におけるスフェロイド全体を示す。パネルBは、単一のスフェロイドのすべての細胞内の細胞質、核およびリソソームのセットセグメンテーションを表示する。細胞質および核は、16進数3、3、3、4、2染色に基づいてセグメント化される。そしてリソソームは、抗ラボ一抗体染色に基づいてセグメント化される。パネル C は、パネル B と同じセグメント化されていますが、3 つのプレーンなビューで示されています。回転楕円体レベルでの様々な形態学的測定が可能である。これらの測定には、スフェロイドあたりの核数の計算、ならびにこれらのpHのフェリシティ、体積、および表面積が含まれる。3つのスフェロイドタイプにおける各セルの典型的な体積。細胞当たりのリソソームの数と同様に、この図に示されている。SP生成開始時の初期セル着座密度を最適化することは、重要なステップです。この図は、あまりにも多くの細胞を加えることで、依然としてスフェロイド形成を可能にすることを示している。しかし、これは回転楕円体であれば融合を生じ得る。このようにして産生されるスフェロイドは、トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析に供することができる。この技術は、薬物送達などのナノ粒子の取り込みを定量的に分析し、スフェロイド中の個々の細胞に対する毒性を評価するために使用される。

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...