Name: a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
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저자들은 Science Foundation Ireland (SFI) (16 / RI / 3745)에서 JCS에 대한 인프라 연구 보조금의 지원을 인정합니다. UCD 세포 스크리닝 실험실에서의 작업은 UCD 과학 대학의 지원을 받습니다. ASC는 아일랜드 연구위원회 (IRC) 아일랜드 대학원 장학금 (GOIPG / 2019 / 68)의 정부에서 자금을 지원합니다. 저자는 또한 실험실의 모든 구성원에게 그들의 의견과 도움이되는 토론에 감사드립니다. 그림 1의 아트웍은 BioRender에서 생성되었습니다.

1. 세포 배양
<ol><li>미디어 준비<ol>
<li>세포주의 종류에 따라 특정 세포 배양 배지를 준비한다. 세포 유지를 위한 모든 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함되어 있는지 확인하십시오. 참고: 다른 세포주는 다른 배지를 사용합니다. HT-29 결장 암종 세포 (ATCC HTB-38)는 맥코이스 5A + 10% FBS에서 성장한다. HepG2 간세포암종 세포(ATCC HB-8065)는 최소 필수 배지 + 1% L-글루타민 + 10% FBS에서 성장한?...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids.">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes.">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).</li><li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations.">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li><li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids.">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904 (2020).</li><li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants+(PDEs)+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery.">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li><li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants,+xenografts+and+organoids:+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer.">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li><li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants.">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li></ol>

여기에 설명된 접근법은 HCS 및 HCA에 적합한 방식으로 웰당 수백 개의 구상체를 생성하기 위한 플랫폼을 상세히 설명한다. 웰 당 하나의 스페로이드 형성 만 허용하는 평평한 바닥 및 둥근 바닥 ULA 플레이트의 사용과 같은 다른 인기있는 방법과 비교할 때,18,19,이 방법은 스크리닝 형식으로 많은 수의 구상체로부터 고해상도 정보를 추출 할 수있는 기회?...

전통적으로, 세포-기반 분석은 고체 기질 상에서 성장하는 단층에서 수행되었으며, 이는 효과적으로 2차원(2D) 환경으로서 고려될 수 있다. 그러나, 2D 세포 배양 모델은 일부 맥락에서 생리학적 관련성이 결여되어 세포들 사이에서 발생하는 많은 복잡한 상호작용을 복제할 수 없다는 것이 점점 더 인식되고 있다1. 3차원(3D) 세포 배양 방법은 연구자들 사이에서 빠르게 인기를 얻고 있으며, 3D 세포 모델은 조직 환경에서 세포가 직면하는 생리적 조건을 더 잘 모방할 수 있는 높은 잠재력을 보여준다2. 사용 된 3D 셀 어셈블리에는 여러 가지 유형이 있지만 가장 일반적인 두 가지 유형은 구상체와 오가노이드입니다. 구상체는 다양한 세포주에서 성장할 수 있으며, 사용되는 세포 유형과 조립 방법에 따라 다양한 모양과 크기를 채택 할 수 있습니다3. 더욱이, 구상체는 또한 이들이 암 세포주로부터 성장할 때 다세포 종양 구상체 (MCTS)로 지칭될 수 있으며, 이들 모델은 전임상 시험관내 약물 전달 및 독성 연구에 특히 사용되는 것을 발견하였다4,5. 반면에 오가노이드는 우리 몸의 조직과 장기를보다 잘 모방하는 것을 목표로하며보다 복잡한 형태 학적 배열을 채택 할 수 있습니다. 오가노이드의 생산은 성체 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포의 사용을 포함하며, 이는 관심있는 조직 또는 기관과 유사한 적절한 세포로 재 프로그래밍 될 수 있습니다. 그들은 주로 장기의 발달을 조사하고 질병 및 숙주 - 병원체 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다6.
3D 셀 어셈블리를 생성하는 데 사용되는 다양한 방법이 있습니다. 스캐폴드-기반 방법은 세포가 부착되거나 성장할 수 있는 기질 또는 지지체를 제공한다. 이러한 스캐폴드는 다양한 형상을 가질 수 있으며 다양한 상이한 재료로 만들어질 수 있다. 가장 흔한 것은 세포외 매트릭스 (ECM) 성분과 하이드로젤이며, 이들은 세포의 자연적인 세포외 환경과 유사하도록 설계되어 생리적 상호작용을 촉진한다4,7. ECM basement 물질은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 종양으로부터 추출되었으며, 라미닌, IV형 콜라겐 및 펄레칸8을 포함하는 ECM 성분의 풍부한 혼합물을 함유하는 것으로 나타났다. 그러나, 그것의 유리한 구성에도 불구하고, 그것의 사용에는 두 가지 주요 과제, 즉 배치 대 배치 가변성과 10 °C8,9 이하와 그 이상의 두 가지 다른 응집체 상태를 갖는다는 것이 있습니다. 대조적으로, 하이드로젤은 그 성분 및 강성에 대하여 유연하다는 장점이 있으며, 이들은 원하는 특정 3D 셀 어셈블리에 적합하도록 맞춤화될 수 있다7,10. 스캐폴드 기반 방법은 오가노이드 성장에 필수적이지만 구상체에도 널리 사용됩니다. 세포가 자라는 표면에 부착되는 것을 방지하여 작동하는 스캐폴드가없는 방법은 일반적으로 스페로이드 어셈블리와 만 호환됩니다. 예를 들어 세포를 구상체로 응집시킬 수 있는 평평한 바닥 또는 U-바닥을 갖는 초저 부착(ULA) 플레이트 또는 스피너/회전 플라스크에서 세포의 지속적인 교반 사용10이 포함됩니다.
다양한 생물학적 사건을 연구하기 위해 3D 세포 어셈블리를 사용하는 것이 빠르게 인기를 얻고 있습니다. 그러나 그들의 문화를 위해 선택된 방법이 적절하고 다운 스트림 분석 계획과 양립 할 수 있어야합니다. 예를 들어, ULA 플레이트의 사용은 높은 일관성의 구상체를 생성한다; 그러나, 이 방법은 웰 당 단일 스페로이드의 생산으로 제한되고, 따라서 처리량을 제한한다. 3D 구조물의 형광 이미징이 계획될 때 특별한 고려가 필요하다. 조립체가 성장되는 기판 또는 플레이트는 광학적으로 호환될 필요가 있으며, 사용되었을 수 있는 임의의 스캐폴드에 의해 야기되는 광산란의 영향을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 한다11. 이 특별한 문제는 현미경 대물 렌즈의 개구수가 증가함에 따라 더욱 심각해진다.
아마도 3D 세포 모델로 작업하기 위해 선택하는 주요 이유 중 하나는 전체 어셈블리뿐만 아니라 그 안에있는 개별 세포에 대한 체적 이미징 데이터를 추출하는 것입니다. 특히 MCTS 모델은 치료제가 외부에서 중앙 세포로 어떻게 전달되는지에 대한 우리의 이해를 심화시키는 데 매우 강력하다는 것을 증명하기 시작했습니다 (종양에서 필요하기 때문에)12, 따라서 다른 층의 개별 세포로부터 지식을 얻는 것이 필수적입니다. 개별 세포로부터 정량적 정보를 추출하는 이미징 기술은 고함량 분석(HCA)이라고 불리며 스크리닝13의 맥락에서 강력한 접근 방식입니다. 현재까지 HCA는 거의 독점적으로 단층 배양에 적용되어 왔지만,이 접근법이 광범위한 세포 기능 및 과정을 연구 할 수있게 해주는 3D 배양에 적용 할 수있는 힘을 가지고 있다는 인식이 증가하고 있습니다14. 많은 수의 3D 어셈블리를 분석하여 각 구조에서 셀 수준 데이터를 제공 할 수 있다는 분명한 이점이 있습니다. 그러나 잠재적으로 두꺼운 셀 어셈블리의 이미징과 관련된 문제 및 생성 된 대규모 데이터 세트는 극복해야합니다.
이 기사에서는 96-웰 포맷으로 MCTS를 대규모로 생산하기 위한 강력한 스캐폴드 기반 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 웰에서 수백 개의 3D 셀 어셈블리를 쉽게 생산할 수 있습니다. 실시예는 간, 폐 및 결장의 고형 종양 모델을 나타내는 세 가지 상이한 세포 유형에 대해 제시된다. 형성되는 구상체는 다양한 크기일 수 있으며, 따라서 HCA는 특정 크기 및/또는 형태학의 구조를 선택하는데 사용된다. 이 기능은 관찰 된 모든 표현형이 다른 크기의 구상체에 걸쳐 비교 될 수 있지만 모두 동일한 웰에서 동일한 방식으로 처리 될 수 있다는 추가적인 이점을 제공합니다. 이 접근법은 고해상도 이미징과 호환되며, 중요한 것은 동일한 셀룰러 어셈블리에서 세포 수준 및 하위 세포 수준의 정량적 데이터를 모두 제공하는 것입니다. 스페로이드 생산의 이러한 방법은 웰 당 단일 스페로이드를 생성하는 방법에 비해 추가적인 이점을 가지며, 각 웰에서 생산된 많은 수의 스페로이드가 전사체 및 프로테옴 프로파일링과 같은 다른 다운스트림 분석을 위해 잠재적으로 충분한 바이오매스를 제공한다는 것이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10050070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>These plates have been renamed as Phenoplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10647032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>10358633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H4A3-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HCSHH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup sterile vacuum filter units</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications

고함량 스크리닝 (HCS) 및 고함량 분석 (HCA)은 연구자들에게 세포에서 대규모 정량적 표현형 측정을 추출 할 수있는 능력을 제공하는 기술입니다. 이 접근법은 세포 생물학에서 근본적인 사건과 적용된 사건의 광범위한 범위에 대한 우리의 이해를 깊게하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 현재까지이 기술에 대한 대부분의 응용 프로그램은 단층에서 자란 세포의 사용에 의존해 왔지만 그러한 모델이 조직에서 발생하는 많은 상호 작용 및 과정을 재검토하지 않는다는 것이 점점 더 실현되고 있습니다. 이와 같이, 구상체 및 오가노이드와 같은 3차원(3D) 세포 어셈블리의 개발 및 사용에 있어서 출현이 있었다. 이러한 3D 모델은 암 생물학 및 약물 전달 연구의 맥락에서 특히 강력하지만, HCS 및 HCA에 적합한 재현 가능한 방식으로 생산 및 분석하는 것은 많은 도전 과제를 제시합니다. 여기에 상술된 프로토콜은 다세포 종양 구상체(MCTS)의 생성을 위한 방법을 설명하고, HCS 및 HCA와 양립가능한 방식으로 세 개의 상이한 세포주에 적용될 수 있음을 입증한다. 이 방법은 웰 당 수백 개의 구상체의 생산을 용이하게하며, 스크리닝 정권에서 사용될 때 웰 당 수백 개의 구조물로부터 데이터를 얻을 수 있으며 모두 동일한 방식으로 처리 할 수 있다는 특별한 이점을 제공합니다. 고분해능 형광 이미징을 위해 구상체를 처리하는 방법과 HCA가 각 스페로이드 내의 개별 세포뿐만 아니라 스페로이드 수준에서 정량적 특징을 추출하는 방법을 자세히 설명하는 예도 제공됩니다. 이 프로토콜은 세포 생물학에서 중요한 질문의 넓은 범위에 대답하기 위해 쉽게 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 다양한 종양 조직을 표현하기 위해 다양한 세포 유형을 사용하여 구상체 형태의 3D 세포 배양 어셈블리를 생산하는 강력한 방법이 자세히 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 웰 당 수백 개의 구상체를 생성 할 수 있으므로 세포 기반 분석을 고함량 방식으로 수행 할 수 있습니다 (그림 1). 이 접근법은 이전에 HT-29 구상체16 에서의 나?...

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A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

이 프로토콜은 자동화된 현미경 검사에 적합한 다중 웰 플레이트의 각 웰에서 수백 개의 다세포 종양 구상체를 생산하는 방법을 제공한다. 생성 된 스페로이드는 다른 크기 클래스로 분류 될 수 있으며 모든 세포에서 아세포 정보를 추출 할 수 있습니다. 이 기술은 직접 스크리닝 및 RNA 간섭 연구에 사용할 수있는 충분한 혈청을 생산합니다.ECM 지하실 재료를 차가운 페놀 레드 세럼프리 배지에 희석하여 섭씨 영하 20도에서 유지되는 미리 냉장 팁을 사용하십시오. ECM 지하실 재료와 중간 용액 15 마이크로 리터를 96 웰 이미징 플레이트에 베팅했습니다. 플레이트를 섭씨 네 도에서 91배 G에서 20분 동안 원심분리한다.플레이트를 섭씨 37도에서 30분 이상 배양하지 않는다. 여행과 EDTA를 셀에 추가하십시오. 인큐베이션이 끝날 때 세포를 섭씨 37도에서 인큐베이션하고, 세포를 10%FBS를 함유하는 완전한 배지에 현탁시킨다.10 마이크로리터의 세포 현탁액을 혈구계 계수 챔버에 피펫. 챔버의 네 사분면에있는 셀 수를 계산하십시오. 센트라는 실온에서 네 분 동안 135배 G에서 세포를 본다.이 세포를 펠릿화하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 페놀 적색 무함유 완전 배지에 재현탁시켜 밀리리터당 6개의 세포에 10의 농도를 얻는다. 세포를 페놀 적색 유리 완전 배지에 희석한다. 세포를 웰 당 35 마이크로리터의 총 부피로 원형 운동으로 적하하는 것을 본다.세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 있는 가습된 인큐베이터에서 한 시간 동안 배양한다. ECM 지하실 물질의 1.2 마이크로리터에서 웰 당 23.8 마이크로리터의 페놀 레드 프리 완전 매질로, 웰 당 60 마이크로리터의 최종 부피를 초래한다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 가습된 인큐베이터에서 배양한다.다음날 배지를 100 마이크로 리터의 신선한 페놀 레드 프리 완전 배지로 교체하십시오. 구상체가 들어있는 96 웰 플레이트를 공초점 고함량 스크리닝 현미경에 삽입하십시오. 사용 된 바닥을 자극 할 적절한 레이저를 선택하십시오.누화를 피하기 위해 채널을 순차적으로 획득하고 적절한 목표를 사용하여 구상체를 이미지화하십시오. 구상체의 형태를 분석하기 위해, 형광 접합된 FLoid에 기초하여 구상체를 분절하고 염색한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다.각 세포의 세포질을 잔류 육각 세 개, 세 개, 네 개, 두 개, 세포질에 존재하는 염색에 의해 분절한다. 부피, 표면적, 구형도 및 그의 구상체 당 핵의 수를 포함하여 구상체의 다른 형태 학적 특성을 계산하십시오. Ross는 75 입방 마이크로 미터보다 작고 900, 000 입방 마이크로 미터보다 큰 구상체를 제거하는 이미지를 추가로 가지고 있습니다.구상체 내의 단일 세포를 분석하기 위해, 형광 컨쥬게이션된 스페로이드 염색에 기초하여 구상체를 분절한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다. 세포질에 존재하는 잔류 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 의해 각 세포의 세포질을 분절한다.이차 항체 염색에 기초하여 리소좀을 분절한다. 세포당 리소좀의 수, 세포 부피 및 세포 표면적을 포함하여 각 구상체 내의 세포의 상이한 형태학적 특성을 계산한다. 이 그림은 서로 다른 공초점 평면의 이미지를 포함하여 세 가지 유형의 구상체에 대한 개요를 잘 보여줍니다.전체 구상체의 체적보기도 표시됩니다. 도면은 pH 세분화 과정을 나타내고, 패널 A는 전체 구상체를 부피 관점에서 보여준다. 패널 B는 단일 구상체의 모든 세포 내에서 세포질, 핵 및 리소좀의 세트 세분화를 표시한다.세포질과 핵은 육각 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 분절된다. 및 리소좀은 항-항체 염색일 실험실에 기초하여 분절된다. 패널 C는 패널 B와 동일한 세그먼트를 표시하지만 세 개의 일반 보기로 표시됩니다.구상체 수준에서 다양한 형태학적 측정이 이루어질 수 있다. 이러한 측정에는 구상체 당 핵의 수뿐만 아니라 이들 펠리시티, 부피 및 pH의 표면적의 계산이 포함됩니다. 세 가지 스페로이드 유형에서 각 세포의 전형적인 부피.세포 당 리소좀의 수뿐만 아니라이 그림에 나와 있습니다. SP 생성 초기에 초기 셀 안착 밀도를 최적화하는 것은 중요한 단계입니다. 그림은 너무 많은 세포를 추가하면 여전히 구상체 형성이 가능하다는 것을 보여줍니다.그러나, 이것은 구상체 인 경우 융합을 초래할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생산된 구상체는 전사체 및 프로테오믹 분석을 거칠 수 있다. 이 기술은 이러한 나노 입자의 약물 전달의 흡수를 정량적으로 분석하고 구상체 내의 개별 세포에 대한 독성을 평가하는 데 사용됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...