Name: a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

Författarna erkänner stödet från ett infrastrukturforskningsbidrag från Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) till JCS. Arbetet i UCD Cell Screening Laboratory stöds av UCD College of Science. ASC finansieras av Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG/2019/68). Författarna tackar också alla medlemmar i labbet för deras input och hjälpsamma diskussioner. Konstverket i figur 1 genererades i BioRender.

1. Cellkultur
<ol><li>Förbereda media<ol>
<li>Förbered specifika cellodlingsmedier beroende på typen av cellinje. Se till att alla medier för cellunderhåll innehåller 10% fosterbovinserum (FBS). OLIKA cellinjer använder olika medier. HT-29 kolon carcinom celler (ATCC HTB-38) odlas i McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulära carcinomceller (ATCC HB-8065) odlas i Minimum Essential Medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. H358 bronchoalveolar carcinom celler (ATCC CRL-5807) odlas i RPMI 1640 medium +...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+liver+models:+state+of+the+art+and+their+application+for+hepatotoxicity+evaluation.">Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation.</a> Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+and+pharmacological+applications+of+three-dimensional+cancer+cell+cultures+and+organoids.">Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids.</a> Life Sciences. 254, 117784 (2020).</li><li>Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+3D+tissue+models+and+their+compatibility+with+live-cell+imaging.">Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).</li><li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+gold+nanorods'+interaction+with+large+3D+pancreatic-stromal+tumor+spheroids+by+multimodal+imaging:+Fluorescence,+photoacoustic,+and+photothermal+microscopies.">Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-based+high-content+screening.">Microscopy-based high-content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mysior, M. M., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell3:+A+new+vision+for+study+of+the+endomembrane+system+in+mammalian+cells.">Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells.</a> Bioscience Reports. , (2021).</li><li>N&#252;rnberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+optical+clearing+of+3D-cell+cultures:+Simplicity+forward.">Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).</li><li>Cutrona, M. B., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-throughput+automated+confocal+microscopy+platform+for+quantitative+phenotyping+of+nanoparticle+uptake+and+transport+in+spheroids.">A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids.</a> Small. 15 (37), 1902033 (2019).</li><li>Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+nanoparticle-induced+toxicity+readouts+with+single+cell+resolution+in+HepG2+multicellular+tumour+spheroids.">Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids.</a> Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+mesenchymal+stem+cell+3D+spheroids+using+low-binding+plates.">Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates.</a> Bio-protocol. 8 (16), (2018).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Eismann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+3D+light-sheet+screening+with+high+spatiotemporal+resolution+reveals+mitotic+phenotypes.">Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).</li><li>Alsehli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+pipeline+for+high-throughput+screening+and+profiling+of+spheroids+using+simple+live+image+analysis+of+frame+to+frame+variations.">An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations.</a> Methods. 190, 33-43 (2021).</li><li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).</li><li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids.">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> eLife. 9, 52904 (2020).</li><li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants+(PDEs)+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery.">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li><li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+explants,+xenografts+and+organoids:+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer.">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li><li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants.">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li></ol>

Metoden som beskrivs här beskriver en plattform för att generera flera hundra sfäroider per brunn på ett sätt som är lämpligt för HCS och HCA. I jämförelse med andra populära metoder, såsom användning av plattbottnade och rundbottnade ULA-plattor, som tillåter bildandet av endast en sfäroid per brunn18,19, ger denna metod möjlighet för högupplöst information att extraheras från ett stort antal sfäroider i ett screeningformat. Denna metod har ...

Traditionellt har cellbaserade analyser utförts i monoskikt som växer på ett fast substrat, vilket effektivt kan betraktas som en tvådimensionell (2D) miljö. Det blir dock alltmer erkänt att 2D-cellkulturmodeller saknar fysiologisk relevans i vissa sammanhang och inte kan replikera många av de komplexa interaktioner som uppstår mellan celler1. Tredimensionella (3D) cellodlingsmetoder blir snabbt populära bland forskare, och 3D-cellmodeller visar hög potential att bättre efterlikna de fysiologiska förhållanden som celler i vävnadsmiljön möter2. Det finns flera olika typer av 3D-cellenheter som har använts, men de två vanligaste typerna är sfäroider och organoider. Sfäroider kan odlas från många olika cellinjer, och de kan anta olika former och storlekar beroende på vilken celltyp som används och deras monteringsmetod3. Dessutom kan sfäroider också kallas multicellulära tumörsfäroider (MCTS) när de odlas från cancer cellinjer, och dessa modeller har funnit särskild användning för preklinisk in vitro-läkemedelsleverans och toxicitetsstudier4,5. Organoider, å andra sidan, syftar till att bättre efterlikna vävnader och organ i vår kropp och kan anta mer komplexa morfologiska arrangemang. Produktionen av organoider innebär användning av vuxna stamceller eller pluripotenta stamceller, som kan omprogrammeras till lämpliga celler för att likna den vävnad eller det organ som är av intresse. De används främst för att undersöka utvecklingen av organ och för att modellera sjukdomar och värdpatogeninteraktioner6.
Det finns en rad olika metoder som används för att generera 3D-cellenheter. Ställningsbaserade metoder ger ett substrat eller stöd till vilket celler antingen kan fästas eller växa inuti. Dessa byggnadsställningar kan ha olika former och kan tillverkas av en mängd olika material. De vanligaste är extracellulära matriskomponenter (ECM) och hydrogeler, och de är utformade för att likna cellernas naturliga extracellulära miljö och därigenom underlätta fysiologiska interaktioner4,7. ECM källarmaterial har extraherats från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom tumör och visat sig innehålla en rik blandning av ECM komponenter, inklusive laminin, typ IV kollagen och perlecan8. Trots dess fördelaktiga sammansättning finns det dock två huvudutmaningar med dess användning, nämligen dess variabilitet från parti till parti och att den har två olika aggregerade tillstånd under och över 10 °C8,9. Däremot har hydrogeler fördelen att de är flexibla med avseende på sina komponenter och styvhet, och de kan anpassas för att passa den specifika 3D-cellenheten som önskas7,10. Ställningsbaserade metoder är viktiga för organoid tillväxt men används också i stor utsträckning för sfäroider. Ställningsfria metoder, som fungerar genom att förhindra att celler fästs på ytan de växer på, är vanligtvis endast kompatibla med sfäroidmontering. Exempel är ultralåga ULA-plattor(ULA), med antingen en platt botten eller U-botten, som möjliggör aggregering av cellerna i sfäroider, eller användning av kontinuerlig omrörning av cellerna i spinner/rotationskolvar10.
Användningen av 3D-cellenheter för att studera en mängd olika biologiska händelser blir snabbt populär; Det är dock viktigt att den metod som valts för deras kultur är lämplig och förenlig med planerna för deras nedströmsanalys. Till exempel genererar användningen av ULA-plattor sfäroider med hög konsistens; Denna metod är dock begränsad till produktion av en enda sfäroid per brunn, vilket begränsar genomströmningen. Särskild hänsyn behövs när fluorescensavbildning av 3D-strukturen planeras. Det substrat eller den platta på vilken monteringen odlas måste vara optiskt kompatibel, och försiktighet måste vidtas för att minimera effekterna av ljusspridning orsakad av eventuella byggnadsställningar som kan ha använts11. Detta speciella problem blir mer akut när mikroskopmållinsernas numeriska bländare ökar.
Förmodligen är en av de främsta anledningarna till att välja att arbeta med en 3D-cellmodell att extrahera volymetriska bilddata om inte bara hela enheten utan också de enskilda cellerna i den. MCTS-modeller, i synnerhet, börjar visa sig vara mycket kraftfulla för att fördjupa vår förståelse för hur terapeutiska transitering från utsidan till centrala celler (som de skulle behöva i en tumör)12, och därför är det viktigt att få kunskap från enskilda celler vid olika lager. Den bildteknik som extraherar kvantitativ information från enskilda celler kallas höginnehållsanalys (HCA) och är ett kraftfullt tillvägagångssätt i samband med screening13. Hittills har HCA nästan uteslutande tillämpats på monolayerkulturer, men det finns en ökande insikt om att detta tillvägagångssätt har kraften att tillämpas på 3D-kulturer som gör det möjligt att studera ett brett spektrum av cellulära funktioner och processer14. Det skulle ha den tydliga fördelen att ett stort antal 3D-sammansättningar kunde analyseras, vilket potentiellt ger data på cellnivå från alla strukturer. Utmaningar i samband med avbildning av potentiellt tjocka cellenheter, liksom de stora datamängder som genereras, måste dock övervinnas.
I den här artikeln presenteras en robust ställningsbaserad metod för storskalig produktion av MCTS i ett 96-välformat. Metoden underlättar produktionen av flera hundra 3D-cellenheter i varje brunn. Exempel visas för tre olika celltyper, som representerar solida tumörmodeller av lever, lunga och kolon. Sfäroiderna som bildas kan vara av olika storlekar, så HCA används för att välja strukturer av en viss storlek och / eller morfologi. Denna funktion ger den extra fördelen att alla fenotyper som observeras kan jämföras över sfäroider av olika storlekar, men alla behandlas på samma sätt i samma brunn. Detta tillvägagångssätt är kompatibelt med högupplöst avbildning, vilket i huvudsak ger både kvantitativa data på cellnivå och subcellulär nivå från samma cellulära sammansättningar. Denna metod för sfäroid produktion har den extra fördelen jämfört med metoder som genererar en enda sfäroid per brunn, att det stora antalet sfäroider som produceras i varje brunn potentiellt ger tillräcklig biomassa för andra nedströmsanalyser, såsom transkriptom och proteomprofilering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10050070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>These plates have been renamed as Phenoplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10647032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>10358633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21090022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H4A3-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8100203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HCSHH14000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup sterile vacuum filter units</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust method for the large-scale production of spheroids for high-content screening and analysis applications

Höginnehållsscreening (HCS) och höginnehållsanalys (HCA) är tekniker som ger forskare möjlighet att extrahera storskaliga kvantitativa fenotypiska mätningar från celler. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara kraftfullt för att fördjupa vår förståelse av ett brett spektrum av både grundläggande och tillämpade händelser inom cellbiologi. Hittills har majoriteten av applikationerna för denna teknik förlitat sig på användningen av celler som odlas i monoskikt, även om det alltmer insers att sådana modeller inte rekapitulerar många av de interaktioner och processer som förekommer i vävnader. Som sådan har det skett en framväxt i utveckling och användning av 3-dimensionella (3D) cellenheter, såsom sfäroider och organoider. Även om dessa 3D-modeller är särskilt kraftfulla i samband med cancerbiologi och läkemedelsleveransstudier, utgör deras produktion och analys på ett reproducerbart sätt som lämpar sig för HCS och HCA ett antal utmaningar. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för generering av multicellulära tumör sfäroider (MCTS), och visar att det kan tillämpas på tre olika cellinjer på ett sätt som är kompatibelt med HCS och HCA. Metoden underlättar produktionen av flera hundra sfäroider per brunn, vilket ger den specifika fördelen att när de används i ett screeningsystem kan data erhållas från flera hundra strukturer per brunn, alla behandlade på ett identiskt sätt. Exempel ges också, som beskriver hur man bearbetar sfäroiderna för högupplöst fluorescensavbildning och hur HCA kan extrahera kvantitativa funktioner både på sfäroidnivå och från enskilda celler inom varje sfäroid. Detta protokoll kan enkelt tillämpas för att svara på ett brett spektrum av viktiga frågor inom cellbiologi.

I detta protokoll beskrivs en robust metod för att producera 3D-cellodlingssammankomster i form av sfäroider, med hjälp av olika celltyper för att representera olika tumörvävnader. Denna metod möjliggör generering av hundratals sfäroider per brunn, vilket gör det möjligt att utföra cellbaserade analyser på ett sätt med högt innehåll (figur 1). Detta tillvägagångssätt har tidigare använts för att studera nanopartiklar upptag i HT-29 sfäroider16 oc...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications at JoVE.com

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

Detta protokoll beskriver en metod för produktion av tre olika typer av sfäroider på ett sätt som gör dem lämpliga för storskalig screening och analys med högt innehåll. Dessutom presenteras exempel som visar hur de kan analyseras på sfäroid- och individcellsnivåer.

En robust metod för storskalig produktion av sfäroider för screening- och analysapplikationer med högt innehåll

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

Detta protokoll ger en metod för att producera flera hundra multicellulära tumör sfäroider i varje brunn av en multi brunn platta lämplig för automatiserad mikroskopi. Spheroid produceras kan kategoriseras i olika storleksklasser, och subcellulär information kan extraheras från varje cell. Tekniken producerar tillräckligt med serum som kan användas i direkt screening och RNA-interferensstudier.Späd ECM källarmaterial i kallt fenolrött serumfritt medium med förkylda spetsar som hålls vid minus 20 grader Celsius. Jag satsar 15 mikroliter av ECM källarmaterial och medium lösning i en 96 brunnsavbildningsplatta. Centrifugera plattan i 20 minuter vid 91 gånger G vid fyra grader Celsius.Inkubera plattan i högst 30 minuter vid 37 grader Celsius. Lägg till resor och EDTA i cellerna. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i slutet av inkubationen, vi suspenderar cellerna i ett komplett medium som innehåller 10%FBS.Pipetter 10 mikroliter av cellupphängningen, i en hemocytometerräkningskammare. Räkna antalet celler i fyra kvadranter i kammaren. Centra visar cellerna vid 135 gånger G i fyra minuter vid rumstemperatur.En av dessa celler är pelleterade, aspirera supernatanten och resuspend cellerna i en fenol röd fri komplett medium för att få en koncentration av 10 till de sex cellerna per milliliter. Späd cellerna i ett fenolrött fritt komplett medium. Se cellerna droppvis i en cirkulär rörelse i en total volym på 35 mikroliter per brunn.Inkubera cellerna i en timme vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid. Vid 1,2 mikroliter ECM källarmaterial till 23,8 mikroliter fenolrött fritt komplett medium per brunn, vilket resulterar i en slutlig volym på 60 mikroliter per brunn. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid.Följande dag, byt ut mediet med 100 mikroliter av färsk fenolrött fritt komplett medium. Sätt in 96-brunnsplattan som innehåller sfäroider i ett konfokalt screeningmikroskop med högt innehåll. Välj lämpliga lasrar för att excitera de golv som används.Skaffa kanalerna sekventiellt för att undvika crosstalk, avbilda sfäroiderna med lämpliga mål. För att analysera morfologin hos sfäroider, segmentera sfäroiderna baserat på den fluorescerande konjugerade FLoid och färgning. Segmentera atomkärnorna baserat på hex tre, tre, tre, fyra, två färgning.Segmentera cytoplasma i varje cell med den återstående hex tre, tre, fyra, två, fläcken som finns i cellens cytoplasma. Beräkna olika morfologiska egenskaper hos sfäroiderna inklusive volym, yta, sfäricitet och antalet kärnor per hans sfäroider. Ross har bilder ytterligare för att ta bort sfäroider mindre än 75 kubikmikrometer och en större än 900 000 kubikmikrometer.För att analysera en enda cell inom sfäroider, segmentera sfäroiderna baserat på den fluorescerande konjugerade sfäroidfärgningen. Segmentera atomkärnorna baserat på hex tre, tre, tre, fyra, två färgning. Segmentera cytoplasma i varje cell med den återstående hex tre, tre, fyra, två fläckar som finns i cellen cytoplasma.Segmentera lysosomerna baserat på den sekundära antikroppsfärgningen. Beräkna olika morfologiska egenskaper hos cellerna inom varje sfäroid, inklusive antalet lysosomer per cell, cellvolym och cellyta. Figuren visar välöversikter över tre olika typer av sfäroider, inklusive bilder på olika konfokala plan.En volymetrisk vy över hela sfäroiderna visas också. Figuren visar pH-segmenteringsprocessen, panel A visar hela sfäroiderna i en volymetrisk vy. Panel B visar den inställda segmenteringen av cytoplasma, kärnor och lysosomer i alla celler i en enda sfäroid.Cytoplasma och kärnor är segmenterade baserat på hex tre, tre, tre, fyra, två färgning. Och lysosomer är segmenterade baserat på antilabbet en antikroppsfärgning. Panel C visar samma segmenterade som panel B, men i tre klartext.Olika morfologiska mätningar på sfäroidnivå kan göras. Dessa mätningar inkluderar beräkning av antalet kärnor per sfäroider, liksom dessa Felicity, volym och yta på pH. Den typiska volymen för varje cell i de tre sfäroidtyperna.Liksom antalet lysosomer per cell visas i denna siffra. Att optimera den ursprungliga cellsätestätheten i början av SP-genereringen är ett kritiskt steg. Figuren visar att om du lägger till för många celler kan sfäroider bildas.Detta kan dock resultera i fusionen om sfäroider. Spheroids producerar på detta sätt kan utsättas för transkriptomisk och proteomisk analys. Denna teknik används för att kvantitativt analysera upptaget av läkemedelsleverans sådana nanopartiklar och bedöma deras toxicitet för enskilda celler i sfäroiderna.

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium analys för Storskaliga SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Storskalig Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med hjälp av dsRNA Feeding bibliotek för att generera Robust förlust-av-funktion Fenotyper

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi för känsliga, storskaliga kvantitativa Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Mätning och analys av extracellulärt Acid Production att bestämma glykolytisk Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

Hög halt Screening Analys För att utvärdera de toxikologiska effekterna av skadliga och potentiellt skadliga beståndsdelar (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: En storskalig metod för multiparameterkvantificering av jästtillväxt

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedur för storskaliga epigenetiska studier

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...