Name: culturing and screening the plant parasitic nematode ditylenchus dipsaci
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci at JoVE.com

Yazarlar, Ditylenchus dipsaci kültürünü sağladığı ve kültür yöntemleri hakkında tavsiyelerde bulunduğu için Dr. Qing Yu'ya (Tarım ve Tarım-Gıda Kanada) teşekkür eder; Dr. Benjamin Mimee (Tarım ve Tarım-Gıda Kanada) ve Nathalie Dauphinais (Tarım ve Tarım-Gıda Kanada) bitki-parazitik nematodların in vitro kültürü hakkında tavsiyeler için; Dr. Andrew Burns ve Sean Harrington, proje ve el yazması hakkında yararlı öneriler için. JK, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursiyeridir. PJR, CIHR proje hibesi (313296) ile desteklenmektedir. PJR, Kimyasal Genetikte Kanada Araştırma Başkanıdır (Tier 1).

Bu çalışma için kullanılan D. dipsaci suşu G-137, Prens Edward County'deki Fish Lake 4 Variety sarımsaktan toplandı ve Tarım ve Tarım-Gıda Kanada tarafından sağlandı. Yeni bir kültüre başlıyorsanız, aşılama metodolojisi15 için Poirier ve ark.'ya danışın.
1. D. dipsaci'nin kültürlenmesi
<ol><li>Daha önce bildirilen çalışmaları takiben medya ve plakaları hazırlayın15.<ol>
<li>23 g/L NA (bakınız Malzeme Tablosu) ve ultra saf su ile 500 mL Besin agar (NA) ortamı hazırlayın. Steril tekniği kullanarak, 25 mL otoklavlanmış NA ortamını 20 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 15 mm derinlikte) dökün. Agar'ın oda sıcaklığında (22 ° C) ~ 2 saat boyunca kapak açıkken katılaşmasına izin verin ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun.</li>
		<li>Minimum organik, 20 g/L sakaroz, 15 g/L agar ve damıtılmış su içeren 3,2 g/L GA bazal ortam içeren 500 mL Gamborg B-5 (GA) ortamı hazırlayın (bkz. Steril tekniği kullanarak, 10 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 25 mm derinlikte) 50 mL otoklavlanmış GA ortamı dökün. Agar'ın oda sıcaklığında (22 °C) kapağı ~ 5 saat açıkken katılaşmasına izin verin ve filiz transferi yapılana kadar steril bir torbada oda sıcaklığında dik olarak saklayın. NOT: Fazla ortam plakaları, kontaminasyonun meydana gelmesi durumunda yapılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki bir çalışmadan modifiye edilmiş bir yöntemi izleyerek tohum sterilizasyonu gerçekleştirin15.<ol>
<li>Bir karıştırma çubuğu, 2 forseps, bir cam petri kabı ve 1 L damıtılmış su ile bir adet 2 L beheri otoklav yapın. 200 mL'lik %95 EtOH çözeltisi ve 200 mL'lik %15'lik ticari ağartıcı çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Bezelye tohumu kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Bir laboratuvar tezgahında bir Bunsen brülör alevinin yakınında bir karıştırma çubuğu bulunan steril bir 2 L beherine 150 tohum dökün.</li>
		<li>Beher içindeki tohumlara 200 mL% 95 EtOH ekleyin, karıştırma plakasında 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve ardından EtOH'yi bir atık kabına dökün.</li>
		<li>Tohumları tamamen batırmak için beherin içine çamaşır suyu çözeltisi dökün. Bir karıştırma plakasında 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın, ardından çamaşır suyunu bir atık kabına dökün.</li>
		<li>Tohumları batırmak için beherin içine damıtılmış su dökün ve 20 dakika boyunca bir karıştırma tabağında kuvvetlice karıştırın. Su yıkamalarını üç kez tekrarlayın, her yıkamadan sonra damıtılmış suyu dökün. Son su yıkamadan sonra, sterilize edilmiş tohumları cam Petri kabına dökün.</li>
		<li>Kirlenmeyi kontrol etmek için, sterilize forseps kullanarak laminer sel davlumbazındaki her 10 cm'lik NA plakasına (adım 1.1.1'de hazırlanan) 6 tohum aktarın. Tohumları plakanın çevresine yerleştirin (dolgun tohumlar en iyi sonucu verir). Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve karanlıkta 26 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edin. NOT: İhtiyaçtan daha fazla tohumun kaplanması, kirlenmemiş tohumların seçici kullanımına izin verecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki adımı izleyerek filiz aktarımı gerçekleştirin.<ol>
<li>Laminer akışlı bir davlumbazda, her GA plakasında 2 kirlenmemiş tohumu plakalamak için sterilize forseps kullanın (adım 1.1.2'de hazırlanmıştır). Plakaları ayrı ayrı laboratuvar ambalaj filmine sarın ve tohumların filizlenmesini sağlamak için oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki bir çalışmadan değiştirilmiş bir yöntemi izleyerek in vitro yetiştirme gerçekleştirin 15.<ol>
<li>50 mL 20 g / L sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Filtre sakkaroz çözeltisini sterilize edin ve bir kenara koyun.</li>
		<li>Laminer bir akış başlığında, mevcut bir kültür plakasından kök dokusu (~ 2cm3) içeren bir agar parçasını kesin. Bezelye fideleri ile yeni GA plakasına 500 μL sakkaroz çözeltisi pipet yerleştirin ve sakkarozun üzerine agar küpü yerleştirin. Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve kültürü oda sıcaklığında (~ 22 ° C) alüminyum folyo ile kaplı bir kutuda tutun.</li>
		<li>Kültürü korumak için her 8-9 haftada bir taze GA plakalarındaki alt kültür nematodları. Nematodlar ~ 8 hafta sonra ekstrakte edilmeye hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. D. dipsaci'nin çıkarılması ve toplanması
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek D. dipsaci ekstraksiyonunu gerçekleştirin.<ol>
<li>Otoklav 50 mL beher, 80 mm huni, 150 mL damıtılmış su ve kahve filtreleri. Huni beher içine yerleştirin ve huniyi steril kahve filtresiyle hizalayın.</li>
		<li>Laminer bir akış başlığında, steril bir neşter kullanarak agar ve kök dokusunu 1cm3'e kesin. Agar küplerini kahve filtresiyle kaplı huniye aktarın ve kahve filtresini nemlendirmek için yavaşça agar üzerine damıtılmış su dökün.</li>
		<li>Kahve filtresiyle kaplı huniyi beherden çıkarın ve kahve filtresiyle kaplı huni değiştirildikten sonra su seviyesi filtrenin dibine dokunana kadar beheri damıtılmış suyla doldurun.</li>
		<li>Kahve filtresi kaplı huniyi ve beheri alüminyum folyo ile örtün. Solucanların kahve filtresinden toplama kabına geçmesine izin vermek için tezgahın üstünde gece boyunca (16 saat) bırakın. NOT: Bir nematod kültürü plakası, bir diseksiyon mikroskobu ile incelendiğinde solucanlar agarın içine girdiğinde ekstraksiyon için hazırdır. Tipik olarak, bir plaka ilk aşılamasından 6-8 hafta sonra ekstraksiyon için hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>D. dipsaci koleksiyonunu gerçekleştirin. NOT: Ertesi gün, D. dipsaci solucanları beherin dibine yerleşmiş olacaktır.<ol>
<li>Kahve filtreli huniyi çıkarın ve toplama kabından üstteki 40 mL suyu aspire edin; yerleşmiş solucanları bozmadığınızdan emin olun. 10 mL'lik plastik serolojik pipet kullanarak, kalan sıvıyı 15 mL'lik konik santrifüj tüpünde toplayın. NOT: Bu koleksiyon doğrudan tahlillerde kullanılabilir. 24 saat içinde kullanılmayacaklarsa 4 ° C'ye yerleştirin. Solucanlar, hareketlilik üzerinde gözle görülür bir etkisi olmadan 4 ° C'de 3 gün boyunca bırakılabilir. Huni'nin çıkarılması, toplama kabındaki solucanları rahatsız edebilir. Toplamadan önce dibe çökelmelerine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In vitro küçük moleküllü ekran
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek tahlil plakalarını hazırlayın.<ol>
<li>Otoklavlanmış damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak, oluktan 40 μL damıtılmış suyu düz tabanlı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sabitleme aletini hazırlayın ve kimyasalları ekleyin<ol>
<li>Bir laboratuvar tezgahındaki Bunsen brülör alevinin yanına iğneleyici tepsileri yerleştirin (bkz. Birbirini izleyen pimleyici tepsilerine aşağıdakileri ekleyin: 25 mL pim temizleme çözeltisi, 35 mL %50 DMSO (suda), 45 mL damıtılmış su, 55 mL %70 EtOH ve 65 mL %95 EtOH. Her tepsinin önüne bir parça kurutma kağıdı yerleştirin</li>
		<li>Temizleme çözeltisindeki pimleri emzirerek ve pimleri çözelti içinde üç kez (3x) yukarı ve aşağı hareket ettirerek sabitleme aletini temizleyin. Bu protokolde, '3x' ve '10x', pinner'ı bir çözelti içinde sırasıyla üç veya on kez yukarı ve aşağı hareket ettirmek olarak tanımlanır. Leke kağıdındaki pimleri lekeleyin. Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın.<ol>
<li>Daha sonra, pimleri damıtılmış suda 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Prosedürü bir kez daha tekrarlayın.</li>
			<li>Son olarak, pimleri% 95 EtOH'de 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Pinner'ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96 delikli kimyasal stok plakalarından kimyasalları, kimyasal plakaya 3x sabitleyerek tahlil plakalarına ekleyin, ardından pimleri 10X'i tahlil plakasına aktarın. Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda dökün.</li>
		<li>Plakalar arasındaki iğneleme aletini aşağıdaki sırayla yıkayarak temizleyin, lekeleme kağıdı üzerinde aralarında leke yapın: %50 DMSO'da 3x (bir kez), damıtılmış suda 3x (bir kez), %75 EtOH'de 3x (bir kez), %95 EtOH'de 3x (iki kez). Pinner'ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin.</li>
		<li>Tüm sabitleme tamamlandığında adım 3.2.2'yi yineleyin. NOT: Tarama, 60 μM'lik son konsantrasyonda gerçekleştirilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanların eklenmesi<ol>
<li>Önce yeniden askıya alarak ve ardından gözlem için bir slayta düşük tutma uçları kullanarak 5 μL'yi pipetleyerek koleksiyondaki nematodların sayısını sayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak 5 μL'deki nematod sayısını sayın.<ol>
<li>Steril damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu 2 solucan / μL'ye ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ve bir oluk kullanarak, 96 delikli plakaların her bir oluğuna 10 μL (~ 20 solucan) ekleyin. NOT: Tarif edilen kültür ve toplama yöntemi kullanılarak kültür plakası başına yaklaşık 15.000 D. dipsaci nematodu toplanacaktır. Kuyu başına yirmi solucan kullanılır, çünkü küçük sayı, mobil ve hareketsiz olanların net bir şekilde görselleştirilmesini ve muhasebeleştirilmesini kolaylaştırır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plakaları laboratuvar ambalaj filmine kapatın ve nemli bir kağıt havluyla sarın. Kutuya yerleştirin ve 200 rpm'de ayarlanmış 20 °C sallama inkübatöründe yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaların minimum hareketini sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyerek plakaların kutuda stabilize edildiğinden emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Veri toplama ve analizi
<ol><li>5. günde plakaları diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO solvent kontrollerindeki ve ilaçla tedavi edilen kuyulardaki mobil ve toplam D. dipsaci sayısını sayın.<ol>
<li>Solucanlar nispeten hareketsizse, 19,20 hareketini uyarmak için kuyuya 40 mM'lik son konsantrasyona 2 μL1 M NaOH ekleyin. NOT: NaOH eklendikten sonra, solucanlar anında hareket eder ve 5 dakika içinde görüntülenmesi gerekir. Mobil solucanların oranını hesaplamak için mobil solucanların sayısı ve toplam solucan sayısı kullanılacaktır. Tahlilin uzunluğu, ekranın amacına bağlı olarak değişebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mobil solucanların oranını hesaplayın. D. dipsaci ekranlarında, tekrarlanabilir bir şekilde% 0 mobil solucan veren kuyular güçlü vuruşlar olarak kategorize edilir. NOT: Diseksiyon mikroskopları aşamasında plakaların uzun süre maruz kalması önlenir, çünkü ışık kaynağı plakaları ısıtabilir ve biyotahlil üzerinde değişken etkilere neden olabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=world+perspective+on+nematology:+the+role+of+the+society.">world perspective on nematology: the role of the society.</a> Vistas on nematology. , 7-14 (1987).</li><li>Abad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+metazoan+plant+parasitic+nematode+Meloidogyne+incognita.">Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).</li><li>Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematodes+threats+to+global+food+security.">Nematodes threats to global food security.</a> Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil &amp; Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).</li><li>Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematicides:+Past+and+present+uses.">Nematicides: Past and present uses.</a> Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , 1179-1200 (2004).</li><li>Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reduced-risk+agricultural+nematicides+-+and+review.">New reduced-risk agricultural nematicides - and review.</a> Journal of nematology. 52, (2020).</li><li>Donely, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+USA+lags+behind+other+agricultural+nations+in+banning+harmful+pesticides.">The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides.</a> Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).</li><li>Polansek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monsanto+halts+launch+of+chemical+after+users+complain+of+rashes.">Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes.</a> Reuters. , (2017).</li><li>Sturhan, D., Brzeski, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+bulb+nematodes,+Ditylenchus+spp.">Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp.</a> Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).</li><li>The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Sheets+on+Quarantine+Pests;+Ditylenchus+dipsaci.+Prepared+by+CABI+and+EPPO+for+the+EU+under+Contract+90/399003.">Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003.</a> The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).</li><li>Quebec (Canada), Agriculture, P&#234;cherie et Alimentation Quebec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;seau+d'avertissements+phytosanitaires+(RAP).+Avertissement+Carotte,+C&#233;leri,+Laitue,+Oignon,+Poireau+[Warning+carrot+celery,+lettuce,+onion,+leek].">R&#233;seau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, C&#233;leri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek].</a> Quebec (Canada), Agriculture, P&#234;cherie et Alimentation Quebec. , (2011).</li><li>Abawi, G. S., Moktan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bloat+nematode+problem+on+garlic:+symptoms,+distribution,+and+management+guidelines.">Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines.</a> Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Nematodes and other worms. , 143-234 (2019).</li><li>Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluopyram+for+the+control+of+Ditylenchus+dipsaci+in+sugar+beet.">Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet.</a> Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).</li><li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematicidal+activity+of+fluensulfone+against+some+migratory+nematodes+under+laboratory+conditions.">Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions.</a> Pest Management Science. 70, 1850 (2014).</li><li>Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., V&#233;ronneau, P. Y., B&#233;lair, G., Gravel, V., Mimee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Range+and+Genetic+Characterization+of+Ditylenchus+dipsaci+Populations+from+Eastern+Canada.">Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada.</a> Plant disease. 103, 456-460 (2019).</li><li>Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+pathogenicity+of+four+Ditylenchus+dipsaci+populations+on+sugar+beet.">Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet.</a> Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).</li><li>K&#252;hnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vivo+bioassay+to+identify+sugar+beet+resistance+to+the+stem+nematode+Ditylenchus+dipsaci.">Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci.</a> Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).</li><li>Burns, A., Luciani, G., Musso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+is+a+useful+model+for+anthelmintic+discovery.">Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery.</a> Nat Communications. 6, (2015).</li><li>Chen, S. Y., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Determining+Live+Second-stage+Juveniles+of+Heterodera+glycines.">A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines.</a> Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).</li><li>Xiang, N., Lawrence, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+In+Vitro+Techniques+for+Distinguishing+between+Live+and+Dead+Second+Stage+Juveniles+of+Heterodera+glycinesand+Meloidogyne+incognita.">Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>US EPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluopyram.">Fluopyram.</a> US EPA. , (2016).</li><li>US EPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluopyram.">Fluopyram.</a> US EPA. , (2020).</li><li>US EPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxamyl+Facts.+Prevention,+Pesticides+and+Toxic+Substances.">Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances.</a> US EPA. , (2000).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Kritik adımlar Protokolün basitliğine rağmen, protokolde başarı olasılığını en üst düzeye çıkarmak için ek dikkati hak eden kritik adımlar vardır. İlk olarak, tohumların aşırı ağartılması büyümelerini bozabilir. Bu nedenle, tohumların ağartma çözeltisindeki süresini 20 dakika veya daha kısa bir süre ile sınırlamak önemlidir. İkincisi, daha önce Storelli ve ark. tarafından belirtildiği gibi, nematodların görünür sağlığı, 4 ° C16'da depolandığında zamanla azalır. Nematodların toplandıktan hemen sonra kullanılması, optimum tarama koşullarının sağlanabileceğine dair ek güven sağlar. Daha uzun süreli depolama gerekli olursa, tüpün kapağının oksijen değişimine izin verecek kadar sıkı olmadığından emin olun. Üçüncüsü, bezelyelerin önerilen süre boyunca NA plakalarında büyümesini sağlamak, deneycinin hangi tohumların kirlendiğini yargılamasını sağlar. Dördüncüsü, nematodları eklemeden önce GA plakalarındaki bezelyelerin aşırı büyütülmesi enfeksiyonu zayıflatacak ve nematod verimini azaltacaktır. Son olarak, kontrol edilmesi zor olan birçok faktör tarama sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için farklı günlerde ve ideal olarak farklı kültür plakalarından toplanan PPN'lerle birden fazla bağımsız çoğaltma ekranı gerçekleştirmek önemlidir.
Yöntemin sınırlamaları Protokoldeki bir sınırlama, toplanan solucanların gençlerden yetişkinlere kadar değişen gelişim aşamasını senkronize edememesidir. Bu nedenle, herhangi bir ekran tarafından ortaya çıkarılan güçlü vuruşlar muhtemelen birden fazla aşamada etkilidir. Bununla birlikte, protokol etkili aşamaya özgü isabetleri gözden kaçırma riskini artırır. İkinci bir husus, in vitro taramanın bir nematisit keşif boru hattında ilk adım olarak düşünülmesi gerektiğidir; Toprak bazlı tahliller, isabetlerin çevrilebilirliğini test etmek için bir boru hattına mükemmel bir ektir.
Protokolün önemi ve uygulanması Burada açıklanan protokoller basittir ve kolayca çoğaltılabilir. Ayrıca, bu protokol, Pratylenchus penetranları da dahil olmak üzere laboratuvardaki diğer PPN'lere sadece küçük değişiklikler yapılarak başarıyla uygulanmıştır. Küresel gıda güvenliğini sağlamak için yeni ve güvenli PPN kontrol önlemlerinin geliştirilmesi esastır. Bu, özellikle D. dipsaci gibi şu anda kabul edilebilir çok çeşitli kimyasal nematisitlere toleranslı olan türler için geçerlidir13,14. Dolayısıyla burada özetlenen protokoller, küresel ölçekte insan sağlığına önemli bir katkı sağlama potansiyeline sahiptir.

Bitki-parazitik nematodların (PPN'ler) küresel gıda üretiminin% 12,3'ünün kaybından sorumlu olduğu ve yılda tahmini 157 milyar dolar hasara neden olduğu tahmin edilmektedir 1,2,3. Ne yazık ki, PPN'leri kontrol etme yeteneği azalmaktadır, çünkü etkili kimyasal nematisitler yasaklanmıştır veya insan güvenliği ve çevresel kaygılar nedeniyle artan kısıtlamalarla karşı karşıya kalmaktadır. Bu öncelikle önceki nesil pestisitlerin zayıf nematod seçiciliğinden kaynaklanmaktadır4. Son 25 yılda, altı yeni kimyasal nematisit pilot olarak uygulandı veya piyasaya sürüldü5. Bunlardan biri Avrupa'da zaten yasaklandı ve bir diğeri insan sağlığı 6,7 üzerindeki etkisi nedeniyle soruşturulurken durduruldu. Bu nedenle, PPN'ler için oldukça seçici olan yeni nematisitlere acil bir ihtiyaç vardır.
Kök ve ampul nematod, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) ekonomik olarak etkili bir PPN4. D. dipsaci, 30 biyolojik ırkta yaklaşık 500 bitki türünü enfekte eder ve çavdar, yulaf, sarımsak, soğan ve pırasa gibi tarımsal açıdan en önemli mahsullerden bazılarını hedefler 8,9. Örneğin, D. dipsaci son zamanlarda Ontario ve Quebec'teki sarımsak tarlalarını temizledi ve bu da% 90'a varan kayıplara neden oldu10,11. Coğrafi dağılımı neredeyse her yerdedir ve Amerika (Kaliforniya ve Florida dahil), Avrupa, Asya'nın çoğu (Çin dahil) ve Okyanusya9'u içerir. D. dipsaci, stomalara yapraklar veya yaralar ve lentiseller üzerinde giren ve hücre duvarını parçalamak için enzimleri serbest bıraktıkları göçmen bir endoparazittir12. D. dipsaci'nin mahsuller üzerindeki etkisini birleştirerek, PPN'nin neden olduğu hasar, bitkiyi ikincil enfeksiyona duyarlı hale getirir11. Ne yazık ki, D. dipsaci diğer nematod suşlarına kıyasla mevcut nematisitlere karşı yüksek tolerans seviyeleri göstermektedir13,14.
Bu protokol, D. dipsaci'nin kültürlenmesini ve küçük molekül adayı nematisitler için büyük ölçekli ekranlarda kullanımını açıklar. Kısaca, D. dipsaci popülasyonları, steril Gamborg B-5 (GA) ortamında kültürlenen bezelye bitkilerinde korunur ve genişletilir15. GA ortamında tohum filizleri yetiştirmeden önce, tohumlar bir dizi yıkamadan geçirilerek sterilize edilmeli ve kontaminasyonu kontrol etmek için besin agar (NA) üzerine kaplanmalıdır. Tohum sterilizasyonu, mevcut olabilecek bakteriyel ve fungal kirleticileri tespit etmek için gereklidir. Kirlenmemiş tohumlar daha sonra tohum filizlerinin enfeksiyona hazırlık olarak büyüyeceği GA plakalarına aktarılır. Tohum filizleri içeren GA plakaları, kök dokusu içeren bir parça agar parçasının taze plakalara aktarılmasıyla önceki bir kültür plakasından nematodlarla enfekte edilir. 6-8 hafta sonra, nematodlar GA ortamından çıkarılır ve kahve filtresiyle kaplı bir huniden bir toplama kabına süzülür. Nematodlar, uygun bir sayı toplandıktan sonra çeşitli biyotahlillerde kullanılabilir. Bu protokolde açıklanan teknik, kültür plakası başına yaklaşık 15.000 D. dipsaci üretir. D. dipsaci yetiştirmek için alternatif protokoller yayınlanmıştır16,17.
Önceki çalışma18'e dayanan bir in vitro küçük molekül tarama testi de burada açıklanmaktadır. Solucan sağlığının bir vekili olarak, kuyu başına 20 nematodun hareketliliği, 5 günlük küçük molekül maruziyetinden sonra incelenir. Solucan hareketliliğini daha iyi görselleştirmek için, canlı solucanların hareketini artırmak için NaOH eklenmiştir19,20. Bu protokol, orta verimli taramaya izin verir ve küçük moleküllerin nematisidal potansiyelini değerlendirmek için değerli veriler sağlar. Farklı bir nematod toplama tekniği kullanılırsa16,17, burada açıklanan küçük molekül tarama metodolojisi yine de uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7747-A10-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L beaker</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL beaker</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>CLS100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminium foil</td>
			<td>Alcan Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGR001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coffee filter</td>
			<td>No name brand</td>
			<td>716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>commercial bleach 6%</td>
			<td>Lavo Pro 6</td>
			<td>DIN102358107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable petri dishes (10cm x 1.5cm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable petri dishes (10cm x 2.5cm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z358762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamborg B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5893-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>MAGNA</td>
			<td>60-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-Free Blotting Paper</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 522-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mutlichannel pipette</td>
			<td>Eppendorf research plus</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70148-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pea seeds</td>
			<td>Ontario Seed Company</td>
			<td>D-1995-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin cleaning solutions</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pinner</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP381N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pinner rinse trays</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips- low retention ? Reg. 200uL</td>
			<td>LABFORCE</td>
			<td>1159M44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir with lid for multichannel pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR703459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>I26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blade</td>
			<td>MAGNA</td>
			<td>sb21-100-a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stir bar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2109 - 1451359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and screening the plant parasitic nematode ditylenchus dipsaci

Bitki-paraziter nematodlar (PPN'ler) her yıl küresel gıda mahsullerinin% 12'sinden fazlasını yok eder ve bu da yılda yaklaşık 157 milyar dolar (USD) kayba eşittir. Büyüyen küresel nüfus ve sınırlı ekilebilir arazi ile, PPN istilasını kontrol etmek gıda üretimi için kritik öneme sahiptir. Mahsul verimini en üst düzeye çıkarmanın zorluğunu birleştirmek, nematod seçiciliğinin eksikliği nedeniyle etkili pestisitler üzerindeki artan kısıtlamalardır. Bu nedenle, yeni ve güvenli kimyasal nematisitler geliştirmek, gıda güvenliği için hayati öneme sahiptir. Bu protokolde, PPN türü Ditylenchus dipsaci kültürü ve koleksiyonu gösterilmiştir. D. dipsaci hem ekonomik olarak zarar verici hem de çoğu modern nematisite karşı nispeten dirençlidir. Mevcut çalışma ayrıca, bu nematodların yeni küçük moleküllü nematisitler için ekranlarda nasıl kullanılacağını ve veri toplama ve analiz metodolojileri hakkındaki raporları da açıklamaktadır. Gösterilen boru hattı, haftada binlerce bileşik verimi sağlar ve Pratylenchus penetrans gibi diğer PPN türleriyle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Burada açıklanan teknikler, giderek daha aç bir dünyayı beslemeye yardımcı olmak için PPN'lerle güvenli bir şekilde mücadele eden oldukça seçici ticari ürünlere dönüşebilecek yeni nematisitleri keşfetmek için kullanılabilir.

Bağımsız replikalar tekrarlanabilir isabetleri ortaya çıkarır Çoğaltma ekranları arasında beklenen varyasyonu göstermek için, numune hareketliliğindeki araçlar ve varyasyon, yakın tarihli bir ekrandan üç temsili plakadan çizilmiştir (Şekil 1). Ekranın üç kopyası üç farklı günde gerçekleştirildi. Her üç plakanın da negatif (yalnızca çözücü) kontrolleri (daha koyu çubuklar) vardır ve set içindeki numuneler yerleşik nematisitler içeriyordu. Kalan bileşikler şu anda Roy laboratuvarında karakterize edilen özel bir kütüphanedendir. Aynı moleküllere sahip C. elegans ile yapılan benzer ekranlara kıyasla (SC, JK, PJR, yayınlanmamış sonuçlar), D. dipsaci ile vuruş oranı önemli ölçüde daha düşüktür ve birçok ilaç plakası hiçbir aktivite göstermez (Şekil 1A). Bazı plakalar tamamen tekrarlanabilir vuruşlara sahiptir (Şekil 1B, C), diğerleri ise aktiviteye göre değişir (Şekil 1C). Taranan diğer türlere göre (gösterilmemiştir), D. dipsaci bileşiklere tepkisinde daha az değişkenlik gösterir. Ne olursa olsun, tekrarlanabilir isabetlerin tanımlanmasında replikaların gerekli olduğu düşünülmektedir.
Nematisitler, Ditylenchus dipsaci'yi hareketsiz hale getirme yeteneklerinde farklılık gösterir. D. dipsaci'ye karşı test edilen yedi karakterize nematisitten sadece Fluopyram, burada açıklanan tahlilde sağlam bir aktivite sergilemektedir (Şekil 1C). Bu, D. dipsaci'nin nematisitlere toleranslı olduğunu gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır13,14. Fluopyram, elektron taşıma zincirinin kompleks II'sini nematod seçici bir şekilde inhibe eder ve Rotylenchulus reniformis ve Meloidogyne incognita4,21,22 dahil olmak üzere çeşitli PPN'leri kontrol etmek için kullanılan ticari bir nematisittir. Fluopyram ve test edilen konsantrasyonda (Oksamil)23'te aktivitesi olmayan nematisitlerden biri, D. dipsaci ile yapılan bir doz-yanıt analizi ile daha ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Fluopyram, EC50 değeri 9,3 μM (8,2 ila 10,5 μM arasında %95 güven aralığıyla) ile D. dipsaci mobilitesi üzerinde doza bağımlı belirgin bir etkiye neden olur (Şekil 2A,B). Bu sonuç, Storelli ve ark., 202013'ün yayınlanan in vitro sonuçlarına dayanarak beklenmektedir. Oksamilin 120 μM konsantrasyona kadar hareketlilik üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur (p = 0.3632, eşlenmemiş t-testi) (Şekil 2C, D).
Sodyum hidroksit tahlil hassasiyetini artırır C. elegans'ın sıvı kültür18'deki neredeyse sürekli yüzme aktivitesinin aksine, D. dipsaci hayvanları önemli ölçüde daha az hareketlidir. Bu, kültür16'daki paraziter nematodlar arasında nadir değildir. 'Dinlendiren' solucanları hasta solucanlardan ayırt etmeye yardımcı olmak için, yetenekli bireylerde hareketi uyarmak için tahlil bitiş noktasında 40 mM NaOH kullanılır (Şekil 3)19,20. Bu teknik, negatif kontrol kuyularındaki tüm solucanların ekranda son derece düşük bir yanlış pozitif arka plan oluşturması ve vermesi göz önüne alındığında, solucanları hareketsiz hale getiren küçük moleküllerin net bir şekilde tanımlanmasına izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> Şekil 1: Ekran çıkışı örnekleri. D. dipsaci ile üç biyolojik replikasyon (açık daireler), gösterilen üç plakanın her birindeki küçük moleküllere (60 μM) karşı gerçekleştirildi. Her üç plaka da DMSO çözücü kontrollerinin% 0.6'sına sahiptir (daha koyu çubuklar). Solvent kontrolleri veya bilinen nematisitlerle aksi belirtilmedikçe, üç plakanın kuyuları, satıcılardan satın alınan nispeten karakterize edilmemiş ilaç benzeri bileşikler içerir (bkz. (A) Küçük molekül kütüphanesinden 96 kuyucuklu bir plaka, D. dipsaci'ye karşı gözlemlenebilir biyoaktiviteye sahip herhangi bir molekülden yoksundur. (B) Küçük molekül kütüphanesinden bir 96 kuyu plakası, D. dipsaci hareketliliğini tekrar üretilebilir şekilde bozan tek bir moleküle sahiptir. (C) Karakterize nematisitler fluopiram (fluo), iprodion (ipro), abamectin (abam), fluensulfone (baca), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) ve wact-11'i içeren 96 kuyucuklu bir ilaç plakası. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> Şekil 2: Hareketlilik testi kullanılarak pozitif ve negatif sonuçlara örnek . (A) D. dipsaci'nin NaOH'nin eklenmesinden 5 gün önce artan fluopiram konsantrasyonlarına maruz kalmasından sonra terminal fenotiplerine örnekler. (B) Belirtilen fluopiram konsantrasyonlarına 5 gün maruz kaldıktan sonra D. dipsaci'nin hareketinin doz-yanıt analizi. (C,D) Oksamil hariç, A, B ile aynıdır. Her grafik, her gün üç çoğaltma ile iki ayrı günde yapılan denemeleri gösterir. Her grafiğin y ekseni, kuyudaki toplam hayvan sayısına göre hareket eden hayvan sayısı olarak hesaplanan her kuyudaki solucanların hareketli fraksiyonunu gösterir. Her iki grafikteki hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> Resim 3: 40 mM NaOH eklendikten sonra D. dipsaci'nin hareketliliği. NaOH ilavesinin D. dipsaci numunelerine 5 günlük ko-inkübasyondan sonra sadece çözücü kontrolü (A), tioksazafen (B) veya fluopyram (C) varlığında etkisi. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci at JoVE.com

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Mevcut protokol, Ditylenchus dipsaci'nin kültürlenmesi, toplanması ve taranması için güvenilir ve basit bir yöntem tanımlamaktadır.

Bitki Parazitik Nematodu Ditylenchus dipsaci Kültürleme ve Eleme

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Bu protokol, Ditylenchus dipsaci ile mücadele etmek için yeni nematisitlerin kültürleme tekniği ve orta verimli kimyasal elekler tarafından keşfedilmesini sağlar. Bu tekniğin basitliği, nematisidal potansiyele sahip bileşikleri tanımlamak için haftada binlerce bileşiğin taranmasına izin verir. Bu teknik, bitkilerin bitki-parazitik nematodlarını öldürmek için yeni bileşikler tanımlayabilir ve bu nedenle küresel gıda arzını artırabilir.Başlamak için, litre başına 23 gram NA ve ultra saf su ile 500 mililitre besin agar veya NA ortamı hazırlayın. Steril tekniği kullanarak, 25 mililitre otoklavlanmış NA ortamını 20 adet tek kullanımlık 100 milimetre çapında, 15 milimetre derinliğinde Petri kabına dökün. Minimum organik madde ile litre başına 3.2 gram GA bazal ortam, litre başına 20 gram sakkaroz, litre agar başına 15 gram ve damıtılmış su içeren 500 mililitre Gamborg B5 veya GA ortamı hazırlayın.Steril tekniği kullanarak, 10 tek kullanımlık Petri kabına 50 mililitre otoklavlanmış GA ortamı dökün. Tohum sterilizasyonunu gerçekleştirmek için, 150 bezelye tohumunu, bir laboratuvar tezgahındaki Bunsen brülör alevinin yakınında bir karıştırma çubuğuna sahip steril iki litrelik bir beherin içine dökün. Tohumlara 200 mililitre% 95 etanol ekleyin ve karıştırma plakasında beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.Ardından, etanol'ü bir atık kabına dökün. Tohumları tamamen batırmak için beherin içine çamaşır suyu çözeltisi dökün. Bir karıştırma plakasında 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.Ardından, çamaşır suyunu bir atık kabına dökün. Tohumları batırmak için beherin içine damıtılmış su dökün ve 20 dakika boyunca bir karıştırma tabağında kuvvetlice karıştırın. Son su yıkamadan sonra, sterilize edilmiş tohumları cam Petri kabına dökün.Kirlenmeyi kontrol etmek için, sterilize forseps kullanarak laminer akış başlığındaki her 10 santimetrelik NA plakasına altı tohum aktarın. Tohumları plakanın çevresine yerleştirin. Plakaları ayrı ayrı laboratuvar sarma filmine sarın ve karanlıkta üç gün boyunca 26 santigrat derecede inkübe edin.Laminer akışlı bir davlumbazda, sterilize forseps ile her GA plakasına kirlenmemiş iki tohum tabaklayın. Tohumların filizlenmesini sağlamak için oda sıcaklığında 7 ila 10 gün boyunca inkübe edin. Litre başına 50 mililitre 20 gram sakkaroz çözeltisi hazırlayın.Filtre sakkaroz çözeltisini sterilize edin ve bir kenara koyun. Laminer bir akış başlığında, mevcut bir kültür plakasından kök dokusu içeren bir agar parçasını kesin. Pipet, bezelye fideleri ile yeni GA plakasına 500 mikrolitre sakkaroz çözeltisi yerleştirin ve sakarozun üzerine bir agar küpü yerleştirin.Kültürü, oda sıcaklığında alüminyum folyo ile kaplı bir kutuda tutun. Kültürü korumak için, nematodları her sekiz ila dokuz haftada bir taze GA plakaları üzerinde alt kültüre alın. Nematodlar yaklaşık sekiz hafta sonra ekstrakte edilmeye hazırdır.Laminer bir akış başlığında, agar ve kök dokusunu steril bir neşterle bir santimetrelik küpler halinde kesin. Agar küplerini kahve filtresiyle kaplı huniye aktarın ve kahve filtresini nemlendirmek için yavaşça agar üzerine damıtılmış su dökün. Kahve filtresiyle kaplı huniyi beherden çıkarın ve kahve filtresiyle kaplı huni değiştirildikten sonra su seviyesi filtrenin dibine dokunana kadar beheri damıtılmış suyla doldurun.Kahve filtresi kaplı huniyi ve beheri alüminyum folyo ile örtün. Solucanları toplamak için, kahve filtresiyle kaplı huniyi çıkarın ve yerleşmiş solucanları bozmadan, toplama kabından en üstteki 40 mililitre suyu aspire edin. Kalan sıvıyı 10 mililitrelik plastik serolojik pipet ile 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne toplayın.Tahlil plakalarını hazırlamak için, otoklav damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve oluktan 40 mikrolitre damıtılmış suyu, çok kanallı pipetli düz tabanlı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın. 96 delikli kimyasal stok plakalarından, kimyasal plakaya üç kez sabitleyerek tahlil plakalarına kimyasallar ekleyin. Ardından, pimleri 10 kez tahlil plakasına aktarın.Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda dökün. Koleksiyondaki nematodların sayısını saymak için önce koleksiyonu yeniden askıya alın ve ardından düşük tutma uçlarını kullanarak çözeltinin beş mikrolitresini bir slayta pipetleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak beş mikrolitredeki nematodların sayısını sayın.Daha sonra, steril, damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu mikrolitre başına iki solucana ayarlayın. Daha sonra, çok kanallı pipet ve oluk ile 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 10 mikrolitre numune ekleyin. Tabakları nemli bir kağıt havluyla sarın ve bir kutuya yerleştirin.Ardından, plakaların minimum hareketini dengelemek ve sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyin ve 200 RPM'ye ayarlanmış 20 santigrat derece sallama inkübatöründe yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaları beşinci günde diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO solvent kontrollerindeki ve ilaçla tedavi edilen kuyulardaki mobil ve toplam D.dipsaci sayısını sayın.Solucanlar hareketsizse, hareketi uyarmak için kuyuya 40 milimolar nihai konsantrasyona iki mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Mobil solucanların oranını hesaplayın. D.dipsaci ekranlarında, tekrarlanabilir bir şekilde% 0 mobil solucan veren kuyular güçlü isabetler olarak kategorize edilir.Üç farklı ilaç plakası, her ilaç plakasının üç biyolojik replikasyona sahip olduğu 60 mikromolar konsantrasyonda tarandı. Her üç plaka da DMSO-solvent kontrollerinin% 6'sını içeriyordu. Küçük molekül kütüphanesinden ilaç içeren birçok plaka, D.dipsaci'ye karşı gözlemlenebilir biyoaktiviteye sahip herhangi bir molekülden yoksundu.Bazı plakalar tamamen tekrarlanabilir vuruşlara sahipken, karakterize nematisitler içeren diğerleri aktivitelerinde değişiklik gösterdi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Burada, fluopyram tahlilde sağlam bir aktivite sergiledi.Fluopyram, EC50 9.3-mikromolar ile D.dipsaci hareketliliği üzerinde belirgin bir doza bağımlı etkiye neden olmuştur. Oksamilin 120 mikromolar konsantrasyona kadar hareketlilik üzerinde önemli bir etkisi yoktu. Oksamil, 120-mikromolar konsantrasyonuna kadar hareketlilik üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi.Sodyum hidroksit ilavesi, hareketsiz solucanların tespitinde tahlil hassasiyetini arttırdı. 40 milimolar sodyum hidroksit, yetenekli bireylerde hareketi uyarmak ve böylece istirahat solucanlarını hasta solucanlardan ayırt etmek için tahlil bitiş noktası olarak kullanılmıştır. Bu protokol, bileşiklerin D.dipsaci ve diğer türlere karşı yeni etki mekanizmalarıyla tanımlanmasını sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi,<em&gt; Orijinli olanlar</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...