Name: using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00
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S.O. è grato all'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca per aver finanziato il suo dottorato di ricerca (sovvenzione ANR-18-CE29-0006).

NOTA: una panoramica del protocollo è fornita nella Figura 1. I parametri utilizzati per gli esperimenti descritti nel presente protocollo sono riportati nella Tabella supplementare S1 e nella Tabella supplementare S2.
1. Preparazione della soluzione campione
NOTA: Il protocollo è descritto utilizzando un pentasaccaride arabinoxilano (23-α-L-arabinofuranosil-xilotetraosio o ...

L'IMS ciclico SELECT SERIES è un potente strumento che consente di selezionare una popolazione di ioni definita, di una data mobilità m/z e ionica, senza la necessità di separazione cromatografica a monte. Lo strumento offre la possibilità di generare una mappa di frammentazione bidimensionale di questa popolazione ionica, da cui è possibile estrarre sia gli spettri MS/MS che IMS/IMS. Tuttavia, l'utente deve notare diversi punti critici che richiedono attenzione durante il processo sperimentale.
<p clas...

La caratterizzazione chimica completa delle biomolecole è fondamentale per comprendere le loro proprietà biologiche e funzionali sottostanti. A tal fine, le scienze "omiche" si sono sviluppate negli ultimi anni, mirando alla caratterizzazione su larga scala di strutture chimiche a concentrazioni biologiche. In proteomica e metabolomica, la SM è diventata uno strumento fondamentale per svelare l'eterogeneità strutturale che si trova nei mezzi biologici, in particolare grazie alla sua sensibilità e capacità di fornire informazioni strutturali attraverso la SM tandem (MS / MS). Nelle strategie MS/MS, uno ione viene selezionato in base alla sua massa, quindi frammentato e, infine, le masse dei suoi frammenti vengono acquisite per stabilire un'impronta digitale della molecola. Gli spettri MS/MS possono, in particolare, essere utilizzati per abbinare database spettrali1,2 o ricostruire provvisoriamente le strutture madri3,4. Nell'ipotesi che spettri simili appartengano a composti simili, i dati MS/MS possono anche essere utilizzati per costruire reti molecolari (MN) che collegano specie correlate attraverso un punteggio di somiglianza5,6.
Tuttavia, a causa della proprietà intrinseca della SM di rilevare il rapporto massa-carica (m / z) degli ioni, la tecnica è cieca a una serie di caratteristiche strutturali che rientrano nell'intervallo dell'isomeria (stereo). Ad esempio, i carboidrati sono costituiti da diverse subunità monosaccaridiche, molte delle quali sono stereoisomeri o addirittura epimeri (ad esempio, Glc vs. Gal o Glc vs. Man). Queste subunità sono collegate da legami glicosidici, che possono differire per la posizione del legame (regioisomerismo) e la configurazione sterica del carbonio anomerico (anomerismo). Queste caratteristiche rendono difficile per la SM autonoma distinguere tra isomeri di carboidrati7 e solo il regioisomerismo può essere affrontato utilizzando metodi di attivazione ad alta energia8,9,10. Sebbene la derivatizzazione sia un'opzione per interrompere l'equivalenza dei gruppi stereoisomerici11, richiede un'ampia preparazione del campione. Un'altra opzione più semplice è quella di accoppiare la SM con una dimensione analitica sensibile all'isomeria, come l'IMS.
Poiché questo protocollo è progettato per gli utenti che hanno già familiarità con i concetti di base di IMS e poiché le recensioni dettagliate sono disponibili altrove12,13, qui viene fornita solo una breve panoramica dei principi di IMS. IMS è un metodo di separazione in fase gassosa che si basa sull'interazione di ioni con un gas tampone e un campo elettrico, separando infine gli ioni in base alle loro conformazioni in fase gassosa. Diversi principi di IMS accoppiati a MS possono essere trovati su strumenti commerciali: alcuni operano alternando campi elettrici alti e bassi (IMS asimmetrico di campo, FAIMS), mentre la maggior parte opera entro il limite di campo basso, in particolare il tubo di deriva IMS (DTIMS, campo elettrico decrescente lineare), l'onda mobile IMS (TWIMS, onde di potenziale simmetrico) e l'IMS intrappolato (TIMS, alto flusso di ioni di intrappolamento del gas tampone contro i campi elettrici)13 . I metodi a basso campo consentono l'accesso a un cosiddetto CCS, una proprietà della coppia ione-gas che rappresenta la superficie (in Å2 o nm2) dello ione che interagisce con il gas tampone durante la separazione. La CCS è teoricamente indipendente dallo strumento ed è quindi utile per generare dati riproducibili tra diversi laboratori14. Le separazioni di mobilità ionica possono essere influenzate da vari parametri e, in particolare, dalle fluttuazioni della pressione del gas e della temperatura del gas nella cella di mobilità. La calibrazione CCS è un modo per rimediare a questo, poiché sia il calibrante che la specie di interesse saranno influenzati in modo simile13. Tuttavia, è obbligatorio installare lo strumento in una stanza a temperatura controllata e disporre di un sistema di controllo della pressione del gas affidabile.
Un'evoluzione interessante dell'IMS è IMS/IMS, che è stato introdotto per la prima volta nel 2006 dal gruppo di Clemmer come analogo di MS/MS15,16. In IMS/IMS, uno ione di interesse è isolato selettivamente in base alla sua mobilità ionica; viene quindi attivato (fino a possibile frammentazione) e viene eseguita una nuova analisi IMS dello ione o dei frammenti attivati. Nel primo progetto strumentale, due celle IMS sono state messe in serie, separate da un imbuto ionico dove si trovava l'attivazione. Da allora, sebbene siano state proposte diverse configurazioni IMS/ IMS (per una revisione, vedi Eldrid e Thalassinos17), il primo spettrometro di massa commerciale con capacità IMS / IMS è diventato disponibile solo nel 201918. Questo strumento ha sostanzialmente migliorato il concetto iniziale combinandolo con un'altra svolta tecnologica: un design ciclico della cella IMS.
La cella IMS ciclica consente teoricamente di aumentare quasi infinitamente la lunghezza del percorso di deriva e, quindi, il potere risolutivo dello strumento19. Ciò è stato ottenuto per mezzo di una particolare geometria dello strumento, in cui la cella ciclica TWIMS è posizionata ortogonalmente all'asse ottico ionico principale. Una regione di matrice multifunzione all'ingresso della cella IMS consente di controllare la direzione del percorso ionico: (i) inviare ioni lateralmente per la separazione IMS, (ii) in avanti per il rilevamento MS o (iii) indietro dalla cella IMS per essere memorizzati in una cella prearray. Da questa cella di conservazione prearray, gli ioni possono essere attivati e i frammenti reiniettati nella cella IMS per la misurazione della mobilità ionica, un approccio che è stato utilizzato con successo per caratterizzare gli stereoisomeri20. In definitiva, i dati raccolti contengono mobilità ionica e informazioni m/z per il precursore e i suoi frammenti.
In una recente pubblicazione che ha utilizzato questo disegno ciclico per le analisi dei glicani (Ollivier et al.21), abbiamo dimostrato che il profilo di mobilità dei frammenti contenuti in tali dati IMS / IMS agisce come un'impronta digitale di una biomolecola che può essere utilizzata in una strategia di rete molecolare. La rete risultante, chiamata IM-MN, ha portato all'organizzazione di set di dati glicemici in modo strutturalmente rilevante, mentre la rete costruita esclusivamente da dati MS / MS (MS-MN) ha rivelato poche informazioni. Per completare questa pubblicazione e aiutare gli utenti di Cyclic IMS a implementare questo flusso di lavoro, questo protocollo fornisce una descrizione completa del protocollo utilizzato per raccogliere i dati. Questo protocollo si concentra solo sulla generazione dei dati IMS/IMS che gli utenti possono quindi utilizzare per costruire reti IM-MN (vedi21) o per qualsiasi altra applicazione di loro scelta. La costruzione di IM-MN non sarà presa in considerazione nel presente documento, poiché i protocolli per il networking molecolare sono già disponibili22. Vengono evidenziati i punti cruciali che devono essere seguiti per generare acquisizioni IMS/IMS preziose e riproducibili. Prendendo l'esempio di uno degli oligosaccaridi studiati da Ollivier et al. 21, i seguenti passaggi sono dettagliati: (i) preparazione del campione, (ii) messa a punto dello strumento IMS ciclico, (iii) peak-picking automatizzato dei dati e (iv) calibrazione CCS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L- plus 23-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XAXXMIX</td>
			<td>XA2XX + XA3XX mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX)</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XA3XX</td>
			<td>Pure XA3XX standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm</td>
			<td>Corning Science M&#233;xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td>
			<td>352070</td>
			<td>Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (ACS reagent, &#8805;99 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td>310468</td>
			<td>Used to dope the sample with lithium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Mix IMS/Tof Calibration Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186008113</td>
			<td>Calibration solution for MS and IMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>721022377</td>
			<td>Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC PLUS Gradient grade</td>
			<td>Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France</td>
			<td>412383</td>
			<td>High-purity solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Leucine Enkephaline Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>700002456</td>
			<td>Reference compound used for tuning of the mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td>
			<td>218012458</td>
			<td>Used to prepare the solution of 500 &#181;M LiCl in 50:50 MeOH/Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186009432</td>
			<td>Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: http://mzmine.github.io/</td>
			<td>MZmine Development Team</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the MZmine software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: https://github.com/siollivier/IM-MN</td>
			<td>INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to an in-house R script containing a CCS calibration function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments

Una caratterizzazione accurata delle strutture chimiche è importante per comprenderne i meccanismi biologici sottostanti e le proprietà funzionali. La spettrometria di massa (MS) è uno strumento popolare, ma non è sempre sufficiente per svelare completamente tutte le caratteristiche strutturali. Ad esempio, sebbene i carboidrati siano biologicamente rilevanti, la loro caratterizzazione è complicata da numerosi livelli di isomeria. La spettrometria di mobilità ionica (IMS) è un complemento interessante perché è sensibile alle conformazioni ioniche e, quindi, all'isomeria. 
Inoltre, i recenti progressi hanno migliorato significativamente la tecnica: l'ultima generazione di strumenti IMS ciclici offre funzionalità aggiuntive rispetto agli strumenti IMS lineari, come un maggiore potere risolutivo o la possibilità di eseguire esperimenti di mobilità ionica tandem (IMS/ IMS). Durante IMS/IMS, uno ione viene selezionato in base alla sua mobilità ionica, frammentato e rianalizzato per ottenere informazioni sulla mobilità ionica sui suoi frammenti. Lavori recenti hanno dimostrato che i profili di mobilità dei frammenti contenuti in tali dati IMS / IMS possono agire come un'impronta digitale di un particolare glicano e possono essere utilizzati in una strategia di rete molecolare per organizzare set di dati glicemici in modo strutturalmente rilevante. 
L'obiettivo di questo protocollo è quindi quello di descrivere come generare dati IMS/IMS, dalla preparazione del campione alla calibrazione finale della sezione trasversale di collisione (CCS) della dimensione di mobilità ionica che produce spettri riproducibili. Prendendo l'esempio di un glicano rappresentativo, questo protocollo mostrerà come costruire una sequenza di controllo IMS / IMS su uno strumento IMS ciclico, come tenere conto di questa sequenza di controllo per tradurre il tempo di arrivo IMS in tempo di deriva (cioè il tempo di separazione effettivo applicato agli ioni) e come estrarre le informazioni di mobilità rilevanti dai dati grezzi. Questo protocollo è progettato per spiegare chiaramente i punti critici di un esperimento IMS/IMS e quindi aiutare i nuovi utenti IMS ciclici a eseguire acquisizioni semplici e riproducibili.

Un pentasaccaride arabinoxilano, XA2XX, è stato scelto come esempio per illustrare questo protocollo. Questo composto è disponibile in commercio, ma solo come miscela con un altro pentasaccaride arabinoxilano, XA3XX (XA3XX puro è anche disponibile in commercio). Le strutture di XA2XX e XA3XX sono riportate nella Figura supplementare S1. Poiché il rapporto tra XA2XX e XA3XX nella miscela commerciale è ~ 50: 50, è stata prep...

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Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

La spettrometria di mobilità ionica (IMS) è un interessante complemento alla spettrometria di massa per la caratterizzazione delle biomolecole, in particolare perché è sensibile all'isomeria. Questo protocollo descrive un esperimento IMS (IMS/IMS) in tandem, che permette l'isolamento di una molecola e la generazione dei profili di mobilità dei suoi frammenti.

Utilizzo di uno spettrometro ciclico per la mobilità ionica per esperimenti di mobilità ionica tandem

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

Il protocollo descrive come registrare un profilo di mobilità ionica per i frammenti prodotti dall'attivazione di una molecola nello spettrometro di massa e come discriminare tra strutture isomeriche. Il protocollo consente di classificare i glicani in 11 gruppi per quanto riguarda alcune delle loro caratteristiche strutturali chiave, e quindi fornire un'informazione altrimenti difficile da ottenere. Può servire a costruire reti molecolari estremamente generiche e adatte a molte famiglie molecolari, come metaboliti o farmaci di interesse in molte aree di ricerca.L'approccio sfrutta al meglio un nuovo concetto di spettrometria di mobilità ionica e sarà utile laddove la spettrometria di massa da sola non riuscirà a discriminare tra due strutture. L'esperimento richiede una buona padronanza della spettrometria di massa e della mobilità ionica. Tuttavia, lo sperimentatore dovrebbe avere successo nell'implementazione del metodo se si segue attentamente ciascuno dei passaggi.A dimostrare la procedura sarà Simon Ollivier, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, impostare una sequenza IMS a passaggio singolo dalla pagina Tune, mettere lo strumento in modalità Mobility e aprire la finestra Cyclic Sequence Control. Selezionare Modalità avanzata dalla scheda Funzioni cicliche di questa nuova finestra, selezionare Aggiungi bundle, quindi Single/Multipass.Attendere che una sequenza di eventi per dispositivi mobili venga visualizzata nella scheda Sequenza della stessa finestra. Adattare la sequenza in modo che tutti gli ioni calibranti facciano un singolo passaggio intorno alla pista IMS ciclica. Non modificare il tempo di iniezione o il tempo di espulsione e acquisizione, tuttavia, abbassare il tempo separato a un millisecondo.Se alcuni ioni della miscela di calibrazione non rientrano nella finestra temporale di arrivo visualizzata, modificare la sincronizzazione dell'IMS con il pusher dell'analizzatore TOF di accelerazione ortogonale aumentando il numero di spinte per contenitore nella scheda Impostazioni ADC. Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra Controllo sequenza ciclica, fare clic su Acquisisci per aprire la finestra popup Impostazioni acquisizione, immettere il nome file, la descrizione e la durata dell'acquisizione, minuti e fare clic su Salva. Passare lo strumento alla modalità TOF dalla pagina MS Tune per verificare la stabilità del segnale.Registrare un'acquisizione completa del campione per un minuto, che sarà utile per verificare il pattern isotopico e la presenza di potenziali contaminanti. Metti lo strumento in modalità MSMS dalla scheda Profilo Quad/MS della pagina principale Tune. Selezionare la massa del ferro bersaglio nel campo di massa MSMS per l'isolamento nel quadrupolo.Registrare un'acquisizione di un minuto per verificare l'isolamento del precursore durante l'elaborazione dei dati. Per eseguire una selezione basata sulla mobilità dell'isomero di interesse, passare lo strumento alla modalità Mobilità nella finestra Controllo sequenza ciclica, dalla scheda Funzioni cicliche selezionare Aggiungi bundle e quindi Slicing. Attendere che nella scheda Sequenza venga visualizzata una sequenza complessa di eventi per dispositivi mobili.Posizionare l'evento Eject and Acquire subito dopo il primo evento Separato, quindi fare clic su Esegui. Cerca i risultati della separazione iniziale da visualizzare in tempo reale. Aumentare la durata del primo evento separato per una separazione multipass modificando il valore temporale per questo evento nella sequenza fino a quando la risoluzione dei picchi IMS non è soddisfacente.Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Fate clic su Pausa (Pause), posizionate l'evento Eject and Acquire sotto gli eventi Eject, Eject to Pre-Store e Hold and Eject. Regolare la durata degli eventi in modo che il picco di destinazione si trovi nell'area Espelli in pre-archiviazione e qualsiasi altro ione si trovi nell'area Espelli o Blocca ed espelli.Posizionate l'evento Eject and Acquire alla fine della sequenza sotto gli eventi Reinject from Pre-Store e i secondi eventi Separate. Fare clic su Esegui per visualizzare la popolazione selezionata. Controllare la qualità dell'isolamento.Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Nella scheda Sequenza, nella colonna accanto agli orari degli eventi definiti dall'utente, cercare i tempi riepilogati di tutti gli eventi. Prendi nota del Time Abs trovato sulla linea dell'evento Reinject from Pre-Store per eseguire la calibrazione CCS.Impostate la durata dell'evento Separate procedendo direttamente su Eject and Acquire su un millisecondo. Nella riga Reinject from Pre-Store selezionare la casella Abilita attivazione e ottimizzare la frammentazione con il controllo incorporato. Se la frammentazione non è soddisfacente con il controllo incorporato, deselezionare la casella Abilita attivazione e procedere all'ottimizzazione manuale delle tensioni di reiniezione, aumentare il gradiente pre-array e abbassare la tensione di offset dell'array fino a quando i risultati non sono soddisfacenti.Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra popup Acquisizione, selezionare l'opzione Mantieni tempo di deriva per generare un file contenente solo i tempi di arrivo, rispetto a M su Z etichettato come _dt.raw. Dopo aver eseguito l'analisi MS della miscela di pentasaccaride arabinoxilano, lo spettro ha mostrato un modello isotopico con un singolo picco a M su Z 685,24 suggerendo che i due composti sono di natura isomerica. Gli addotti dei pentasaccaridi sono stati separati attraverso la cella IMS ciclica e tre picchi sono stati separati con tempi di arrivo diversi.L'XA3XX puro mostra i picchi a 83 e 90 millisecondi, mentre l'XA2XX mostra un picco a 94 millisecondi. Dopo il primo stadio di separazione IMS, gli ioni appartenenti a XA3XX sono stati espulsi e il picco a 94 millisecondi è stato selezionato per l'analisi IMS-IMS. Una separazione a tre passaggi è stata eseguita dopo aver reiniettato lo ione senza attivazione e un picco per XA2XX è stato ottenuto a 199 millisecondi.I dati IMS-IMS MS generati sono stati de-convoluti utilizzando l'ora di arrivo e le dimensioni M su Z, generando gli spettri IMS-IMS. I picchi superiori allo 0,2% di intensità relativa sono stati esportati per la calibrazione CCS, risultando in uno spettro IMS-IMS calibrato CCS centroidato. È sempre importante controllare l'isolamento dello ione precursore, altrimenti lo spettro potrebbe provenire da una miscela del composto di interesse e dei contaminanti.In precedenza abbiamo utilizzato spettri IMS-IMS per costruire reti e classificare composti, ma potrebbero anche essere utilizzati per cercare nei database le identificazioni dei composti. Questa tecnica è molto recente, ma ci aspettiamo che sarà estremamente utile in glicomica così come in qualsiasi contesto in cui gli analisti si confrontano con molecole isomeriche.

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