Name: using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00
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S.O.は、博士号(助成金ANR-18-CE29-0006)に資金を提供してくれたフランス国立研究庁に感謝しています。

メモ: プロトコルの概要を図 1 に示します。本プロトコールに記載される実験に使用されるパラメータは、補足表S1および補足表S2に見出すことができる。
試料溶液の調製
注:このプロトコルは、例としてアラビノキシラン五糖(23-α-L-アラビノフラノシル-キシロテトラオースまたは<sup...

SELECT SERIES サイクリックIMSは、上流のクロマトグラフィー分離を必要とせずに、所定の m/z とイオン移動度の定義済みイオン集団を選択できる強力なツールです。この装置は、このイオン集団の二次元フラグメンテーションマップを生成する可能性を提供し、そこからMS/MSスペクトルとIMS/IMSスペクトルの両方を抽出することができます。ただし、ユーザーは、実験プロセス中に注意を必...

生体分子の完全な化学的特性評価は、その根底にある生物学的および機能的特性を理解するための鍵です。この目的のために、近年、「オミックス」科学が発展し、生物学的濃度での化学構造の大規模な特徴付けを目指している。プロテオミクスおよびメタボロミクスにおいて、MSは、特にタンデムMS(MS/MS)を介して構造情報を提供する感度と能力のおかげで、生物学的媒体に見られる構造的不均一性を解明するためのコアツールとなっている。MS/MS戦略では、イオンはその質量に応じて選択され、次いで断片化され、そして最後に、その断片の質量が分子のフィンガープリントを確立するために獲得される。MS/MSスペクトルは、特に、スペクトルデータベース1,2を一致させるために、または親構造3,4を暫定的に再構築するために使用することができる。類似のスペクトルが類似の化合物に属するという仮定の下で、MS/MSデータは、類似性スコア5,6を介して近縁種をつなぐ分子ネットワーク(MN)を構築するためにも使用することができる5,6。
しかし、イオンの質量電荷比(m / z)を検出するMSの固有の特性のために、この技術は(立体)異性性の範囲内にある多くの構造的特徴に盲目的である。例えば、炭水化物はいくつかの単糖サブユニットからなり、その多くは立体異性体またはエピマー(例えば、Glc対GalまたはGlc対Man)である。これらのサブユニットはグリコシド結合によって連結されており、これは結合の位置(位置異性)およびアノマー炭素の立体配置(アノマー性)によって異なる可能性がある。これらの特性により、スタンドアロンMSが炭水化物異性体を区別することは困難であり7、高エネルギー活性化法を使用して位置異性のみに対処することができます8,9,10。誘導体化は立体異性体基の等価性を破壊するための選択肢ですが11、広範なサンプル調製が必要です。もう1つのより簡単な選択肢は、MSをIMSなどの異性化に敏感な分析次元と組み合わせることです。
このプロトコルは、IMS の基本概念に既に精通しているユーザー向けに設計されており、詳細なレビューは他の場所で入手できるため12,13 ここでは、IMS の原則の簡単な概要のみを示します。IMSは、イオンとバッファーガスおよび電場との相互作用に依存し、最終的に気相立体構造に従ってイオンを分離する気相分離法である。MSに結合されたIMSのさまざまな原理は、商用機器で見つけることができます:いくつかは交互の高電界と低電界(電界非対称IMS、FAIMS)で動作しますが、ほとんどは低磁界限界内で動作します - 特にドリフトチューブIMS(DTIMS、直線的に減少する電界)、進行波IMS(TWIMS、対称電位波)、およびトラップされたIMS(TIMS、電界に対してイオンをトラップするバッファガスの高流量)13.低磁場法は、分離中にバッファーガスと相互作用するイオンの表面(Å2またはnm2)を表すイオン - ガス対の特性である、いわゆるCCSへのアクセスを可能にする。CCSは理論的には機器に依存しないため、異なるラボ間で再現できるデータを生成するのに役立ちます14。イオン移動度分離は、様々なパラメータによって、特に移動度セル内のガス圧力およびガス温度の変動によって影響を受ける可能性がある。CCSキャリブレーションは、キャリブラントと対象種の両方が同様に影響を受けるため、これを改善する方法です13。ただし、温度制御された部屋に機器を設置し、信頼性の高いガス圧力制御システムを持つことが必須です。
IMSの興味深い進化はIMS/IMSであり、これは2006年にクレマーのグループによってMS/MS15,16のアナログとして初めて導入された。IMS/IMSでは、目的のイオンは、そのイオン移動度に基づいて選択的に単離される。その後、(フラグメンテーションが可能になるまで) 活動化され、活動化されたイオンまたはフラグメントの新しい IMS 分析が実行されます。最初の機器設計では、2つのIMSセルを直列に配置し、活性化が立っていたイオン漏斗によって分離した。それ以来、多くのIMS/IMSセットアップが提案されましたが(レビューについては、EldridとThalassinos17を参照)、IMS/IMS機能を備えた最初の商用質量分析計は201918年に利用可能になりました。この装置は、IMSセルの循環設計という別の技術的ブレークスルーと組み合わせることで、初期の概念を大幅に改善しました。
周期的なIMSセルは、理論的には、ドリフトパスの長さをほぼ無限に増加させ、したがって、計測器19の分解能を増加させることを可能にする。これは、環状TWIMSセルが主イオン光軸に対して直交して配置される特定の機器形状によって達成された。IMS セルの入り口にある多機能アレイ領域は、(i) IMS 分離のためにイオンを横向きに送る、(ii) MS 検出のために前方に送る、または (iii) IMS セルから後方にプリアレイ・セルに格納する、イオン経路の方向を制御することができます。このプレアレイストアセルから、イオンを活性化し、フラグメントをイオン移動度測定のためにIMSセルに再注入することができ、このアプローチは立体異性体20を特徴付けるために首尾よく使用されている。最終的に、収集されたデータには、前駆体とその断片のイオン移動度と m / z 情報が含まれています。
グリカン分析にこの環状設計を使用した最近の出版物(Ollivier et al.21)では、このようなIMS/IMSデータに含まれるフラグメントの移動度プロファイルが、分子ネットワーク戦略に使用できる生体分子のフィンガープリントとして機能することを示した。その結果、IM-MNと呼ばれるネットワークは、構造的に関連する方法でグリコミクスデータセットの組織化につながったが、MS / MSデータ(MS-MN)のみから構築されたネットワークはほとんど情報を明らかにしなかった。本書を補完し、Cyclic IMS ユーザーがこのワークフローを実装できるように、このプロトコルには、データの収集に使用されるプロトコルの完全な説明が記載されています。このプロトコルは、ユーザーが IM-MN ネットワークの構築に使用できる IMS/IMS データの生成 (21 を参照) のみに焦点を合わせています (または、ユーザーが選択したその他のアプリケーションに対して)。IM-MNの構築は、分子ネットワークのためのプロトコルがすでに利用可能であるため、ここでは考慮されません22。貴重で再現可能な IMS/IMS 集録を生成するために従わなければならない重要なポイントが強調表示されます。Ollivierらによって研究されたオリゴ糖の1つを例 にとる。図21では、(i)サンプル調製、(ii)サイクリックIMS機器のチューニング、(iii)データの自動ピークピッキング、および(iv)CCSキャリブレーションのステップが詳述されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L- plus 23-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XAXXMIX</td>
			<td>XA2XX + XA3XX mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX)</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XA3XX</td>
			<td>Pure XA3XX standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm</td>
			<td>Corning Science M&#233;xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td>
			<td>352070</td>
			<td>Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (ACS reagent, &#8805;99 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td>310468</td>
			<td>Used to dope the sample with lithium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Mix IMS/Tof Calibration Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186008113</td>
			<td>Calibration solution for MS and IMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>721022377</td>
			<td>Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC PLUS Gradient grade</td>
			<td>Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France</td>
			<td>412383</td>
			<td>High-purity solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Leucine Enkephaline Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>700002456</td>
			<td>Reference compound used for tuning of the mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td>
			<td>218012458</td>
			<td>Used to prepare the solution of 500 &#181;M LiCl in 50:50 MeOH/Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186009432</td>
			<td>Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: http://mzmine.github.io/</td>
			<td>MZmine Development Team</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the MZmine software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: https://github.com/siollivier/IM-MN</td>
			<td>INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to an in-house R script containing a CCS calibration function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments

化学構造の正確な特性評価は、その根底にある生物学的メカニズムと機能的特性を理解するために重要です。質量分析(MS)は一般的なツールですが、すべての構造的特徴を完全に明らかにするには必ずしも十分ではありません。例えば、炭水化物は生物学的に関連性があるが、それらの特性評価は多数のレベルの異性化によって複雑である。イオン移動度分光法(IMS)は、イオン立体構造に敏感であり、したがって異性性に敏感であるため、興味深い補完物です。 
さらに、最近の進歩により、この技術が大幅に改善されました:前世代のサイクリックIMS計測器は、分解能の向上やタンデムイオンモビリティ(IMS/IMS)実験の実行可能性など、リニアIMS計測器と比較して追加の機能を提供します。IMS/IMS では、イオンの移動度に基づいてイオンが選択され、断片化され、再分析されて、その断片に関するイオン移動度情報を取得します。最近の研究は、このようなIMS/IMSデータに含まれる断片の移動度プロファイルが、特定のグリカンのフィンガープリントとして機能し、構造的に関連する方法でグリコミクスデータセットを編成するための分子ネットワーキング戦略に使用できることを示した。 
したがって、このプロトコルの目的は、サンプル調製から再現可能なスペクトルを生成するイオン移動度寸法の最終的な衝突断面(CCS)較正まで、IMS/IMSデータを生成する方法を記述することです。1つの代表的なグリカンの例を挙げると、このプロトコルは、サイクリックIMS機器上にIMS/IMS制御シーケンスを構築する方法、IMS到着時間をドリフト時間(すなわち、イオンに適用される有効な分離時間)に変換するためにこの制御シーケンスを考慮する方法、および生データから関連するモビリティ情報を抽出する方法を示す。このプロトコルは、IMS/IMS 実験の重要なポイントを明確に説明し、新しいサイクリック IMS ユーザーが簡単で再現可能な集録を実行するのに役立つように設計されています。

アラビノキシラン五糖XA2XXを、このプロトコルを説明する例として選択した。この化合物は市販されているが、別のアラビノキシラン五糖との混合物としてのみ、XA3XX(純粋なXA3XXも市販されている)。XA2XX および XA3XX の構造は、補足図 S1 に示されています。市販の混合物中のXA2XXとXA3XXの比が〜50:50となるように、混合物の20μg/mLの?...

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Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

イオン移動度分析(IMS)は、生体分子の特性評価のための質量分析を補完する興味深いものであり、特に異性化に敏感であるためです。このプロトコルは、分子の単離とその断片の移動度プロファイルの生成を可能にするタンデムIMS(IMS/IMS)実験を記述します。

タンデムイオン移動度実験のための周期的イオン移動度分光計の使用

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

このプロトコルは、質量分析計で分子の活性化時に生成されるフラグメントのイオン移動度プロファイルを記録し、異性体構造を区別する方法を記述しています。このプロトコルは、グリカンをその主要な構造的特徴のいくつかに関して11のグループに分類することを可能にし、したがって、そうでなければ得ることが困難な情報を提供する。それは非常に一般的であり、多くの研究分野で関心のある代謝産物や薬物など、多くの分子ファミリーに適した分子ネットワークを構築するのに役立ちます。このアプローチは、イオン移動度分析における新しい概念を最大限に活用し、質量分析だけでは2つの構造を区別できない場合に有用であろう。この実験には、質量分析とイオン移動度の優れたコマンドが必要です。ただし、実験者は、各手順に注意深く従えば、メソッドの実装に成功するはずです。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるサイモン・オリヴィエです。まず、TuneページからシングルパスIMSシーケンスを設定し、計測器をモビリティモードにして、サイクリックシーケンス制御ウィンドウを開きます。この新しいウィンドウの「サイクリック機能」タブから「詳細モード」を選択し、「バンドルの追加」を選択してから、「シングル/マルチパス」を選択します。モビリティ イベントのシーケンスが同じウィンドウの [シーケンス] タブに表示されるのを待ちます。すべてのキャリブラントイオンがサイクリックIMS競馬場の周りを1回通過するようにシーケンスを調整します。ただし、注入時間またはイジェクト時間と集録時間は変更しないでください。ただし、分離時間を 1 ミリ秒に下げてください。キャリブレーション混合気の一部のイオンが表示された到着時間ウィンドウに収まらない場合は、[ADC 設定]タブでビンあたりのプッシュ数を増やして、IMSと直交加速度TOFアナライザのプッシャーとの同期を変更します。「サイクリックシーケンスコントロール」ウィンドウで 2 分間の集録を記録するには、「集録」をクリックして「集録設定」ポップアップウインドウを開き、「ファイル名」、「説明」、および「集録の長さ」(分) を入力して、「保存」をクリックします。MS Tuneページから計測器をTOFモードに切り替えて、信号の安定性を確認します。サンプルの完全なMS取得を1分間記録すると、同位体パターンと潜在的な汚染物質の存在を確認するのに役立ちます。メインのTuneページのQuad/MSプロファイルタブから計測器をMSMSモードにします。四重極での単離のためにMSMS質量フィールドでターゲット鉄の質量を選択します。1分間の集録を記録して、データ処理時に前駆体の分離を確認します。目的の異性体のモビリティベースの選択を実行するには、サイクリックシーケンスコントロールウィンドウで計測器をモビリティモードに切り替え、「サイクリック機能」タブから「バンドルを追加」を選択し、「スライス」を選択します。モビリティ イベントの複雑なシーケンスが [シーケンス] タブに表示されるのを待ちます。取り出しイベントと取得イベントを最初の分離イベントの直後に配置し、[実行] をクリックします。リアルタイムで表示される初期分離の結果を探します。IMS ピークの解決が満足のいくものになるまで、シーケンス内のこのイベントの時間値を変更して、マルチパス分離の最初の分離イベントの継続時間を長くします。参照用に1分間の集録を記録します。「一時停止」をクリックし、「取り出し」イベントと「取得」イベントを「取り出し」、「プリストアへの取り出し」、および「保留」および「取り出し」イベントの下に配置します。ターゲットピークが「イジェクトからプリストアへ」領域にあり、その他のイオンが「イジェクト」領域または「ホールドアンドイジェクト」領域にあるように、イベントの継続時間を調整します。イジェクト イベントと取得イベントは、シーケンスの最後に、プレストアからの再注入イベントと 2 番目の個別のイベントの下に配置します。[実行]をクリックして、選択した母集団を表示します。分離の品質を確認します。参照用に1分間の集録を記録します。「シーケンス」タブのユーザー定義イベント時刻の横にある列で、すべてのイベントの集計時刻を探します。CCS キャリブレーションを実行するための [プレストアから再注入] イベントの行で見つかった時間 Abs に注意してください。イジェクトと集録を直接進める Separate イベントの継続時間を 1 ミリ秒に設定します。[ストア前から再挿入] 行で、[アクティブ化を有効にする] ボックスをオンにし、組み込みコントロールを使用して断片化を最適化します。フラグメンテーションが内蔵コントロールで満足のいくものでない場合は、[アクティブ化を有効にする]ボックスのチェックを外し、再注入電圧を手動で最適化し、プリアレイ勾配を増加させ、結果が満足できるまでアレイオフセット電圧を下げます。「集録」ポップアップウィンドウで 2 分間の集録を記録するには、「ドリフト時間を保持」オプションにチェックマークを付けて、到着時刻のみを含むファイルを生成します。一方、Z 上の M は_dt.rawとラベル付けされています。アラビノキシラン五糖混合物のMS分析を実施した後、スペクトルはMオーバーZ 685.24に単一のピークを有する同位体パターンを表示し、2つの化合物が本質的に異性体であることを示唆した。環状IMS細胞を通して五糖の付加物を分離し、異なる到着時間で3つのピークを分離した。純粋なXA3XXは83ミリ秒と90ミリ秒でピークを示し、XA2XXは94ミリ秒でピークを示します。IMS分離の第1段階の後、XA3XXに属するイオンが放出され、94ミリ秒のピークがIMS-IMS分析のために選択された。活性化せずにイオンを再注入した後、3パス分離を行い、199ミリ秒にXA2XXのピークが得られた。生成されたIMS-IMS MSデータは、Z次元上の到着時間とMを使用してデコンボレーションされ、IMS-IMSスペクトルが生成されました。相対強度が0.2%を超えるピークはCCSキャリブレーション用にエクスポートされ、重心付きCCSキャリブレーションされたIMS-IMSスペクトルが得られました。前駆体イオンの単離を確認することは常に重要であり、さもなければ、スペクトルは目的の化合物と汚染物質との混合物から来るかもしれない。以前はIMS-IMSスペクトルを使用してネットワークを構築し、化合物を分類していましたが、化合物の識別をデータベースから検索するためにも使用できました。この手法は非常に最近のものですが、グリコミクスやアナリストが異性体分子に直面するあらゆる状況で非常に有用であると期待しています。

Research

JoVE Journal

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