Name: using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00
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S.O. agradece à Agência Nacional de Pesquisa francesa por financiar seu Doutorado (conceder ANR-18-CE29-0006).

NOTA: Uma visão geral do protocolo é fornecida na Figura 1. Os parâmetros utilizados para os experimentos descritos no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2.
1. Preparação da solução amostral
NOTA: O protocolo é descrito usando um pentasacarídeo arabinoxylan (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose ou XA2XX; veja a <str...

O SELECT SERIES Cyclic IMS é uma ferramenta poderosa que permite selecionar uma população de íons definida — de uma determinada mobilidade m/z e íon — sem a necessidade de separação cromatográfica a montante. O instrumento oferece a possibilidade de gerar um mapa de fragmentação bidimensional dessa população de íons, a partir do qual podem ser extraídos espectros de MS/MS e IMS/IMS. No entanto, o usuário deve observar vários pontos críticos que requerem atenção durante o processo experimen...

A caracterização química completa das biomoléculas é fundamental para entender suas propriedades biológicas e funcionais subjacentes. Para isso, as ciências da "omics" têm se desenvolvido nos últimos anos, visando a caracterização em larga escala de estruturas químicas em concentrações biológicas. Em proteômica e metabolômica, a MS tornou-se uma ferramenta central para desvendar a heterogeneidade estrutural encontrada na mídia biológica - notadamente graças à sua sensibilidade e capacidade de fornecer informações estruturais através de tandem MS (MS/MS). Nas estratégias de MS/MS, um íon é selecionado de acordo com sua massa, depois fragmentado, e finalmente, as massas de seus fragmentos são adquiridas para estabelecer uma impressão digital da molécula. Os espectros de MS/MS podem, em particular, ser usados para combinar bancos de dados espectrais1,2 ou reconstruir provisoriamente as estruturas-mãe3,4. Sob a suposição de que espectros semelhantes pertencem a compostos semelhantes, os dados de MS/MS também podem ser usados para construir redes moleculares (MNs) conectando espécies relacionadas através de um escore de similaridade5,6.
No entanto, devido à propriedade inerente da EM para detectar a relação massa-carga (m/z) de íons, a técnica é cega para uma série de características estruturais que se enquadram na faixa do isomerismo (estéreo). Por exemplo, os carboidratos são feitos de várias subunidades de monossacarídeos, muitas das quais são estereólogos ou mesmo epimers (por exemplo, Glc vs. Gal ou Glc vs. Man). Essas subunidades estão ligadas por ligações glicosidicas, que podem diferir pela posição da ligação (regioisomerismo) e pela configuração estérica do carbono anomérico (anomerismo). Essas características dificultam a distinção entre isômeros de carboidratos7, e apenas o regioisomerismo pode ser abordado usando métodos de ativação de alta energia8,9,10. Embora a derivatização seja uma opção para interromper a equivalência de grupos estereosméricos11, requer uma preparação extensiva da amostra. Outra opção mais simples é acoplamento de ESM com uma dimensão analítica sensível ao isômerismo, como o IMS.
Como este protocolo é projetado para usuários que já estão familiarizados com os conceitos básicos do IMS, e como avaliações detalhadas estão disponíveis em outros lugares12,13, apenas uma breve visão geral dos princípios do IMS é dada aqui. IMS é um método de separação em fase de gás que se baseia na interação de íons com um gás tampão e um campo elétrico, separando íons de acordo com suas conformações de fase gasosa. Diferentes princípios do IMS acoplados à MS podem ser encontrados em instrumentos comerciais: alguns operam em campos elétricos alternados de alta e baixa (IMS assimétricos de campo, FAIMS), enquanto a maioria opera dentro do limite de campo baixo — notavelmente o tubo de deriva IMS (DTIMS, campo elétrico decrescente linear), imS de onda itinerante (TWIMS, ondas potenciais simétricas) e IMS preso (TIMS, alto fluxo de íons de captura de gás tampão contra campos elétricos)13 . Os métodos de campo baixo permitem o acesso a um chamado CCS, uma propriedade do par de gás íon que representa a superfície (em Å2 ou nm2) do íon que interage com o gás tampão durante a separação. O CCS é teoricamente independente de instrumentos e, portanto, é útil para gerar dados que podem ser reproduzidos entre diferentes laboratórios14. As separações de mobilidade de íons podem ser impactadas por vários parâmetros e, notadamente, por flutuações da pressão do gás e da temperatura do gás na célula de mobilidade. A calibração do CCS é uma forma de remediar isso, pois tanto o calibrante quanto a espécie de interesse serão igualmente afetados13. No entanto, é obrigatório instalar o instrumento em uma sala controlada pela temperatura e ter um sistema de controle de pressão de gás confiável.
Uma evolução interessante do IMS é o IMS/IMS, que foi introduzido pela primeira vez em 2006 pelo grupo de Clemmer como um analógico de MS/MS15,16. No IMS/IMS, um íon de interesse é isolado seletivamente com base em sua mobilidade de íons; em seguida, é ativado (até possível fragmentação), e uma nova análise do IMS do íon ativado ou fragmentos é realizada. No primeiro design instrumental, duas células IMS foram colocadas em série, separadas por um funil de íons onde a ativação estava. Desde então, embora uma série de configurações IMS/IMS tenham sido propostas (para revisão, consulte Eldrid e Thalassinos17), o primeiro espectrômetro de massa comercial com capacidade IMS/IMS só ficou disponível em 201918. Este instrumento melhorou substancialmente o conceito inicial, combinando-o com outro avanço tecnológico: um design cíclico da célula IMS.
A célula IMS cíclica teoricamente permite aumentar quase infinitamente o comprimento do caminho de deriva e, assim, o poder de resolução do instrumento19. Isso foi conseguido por meio de uma geometria de instrumento particular, onde a célula Cíclica TWIMS é colocada ortogonalmente ao eixo óptico de íon principal. Uma região de matriz multifuncional na entrada da célula IMS permite controlar a direção do caminho de íon: (i) enviar íons para os lados para a separação do IMS, (ii) para a frente para detecção de MS ou (iii) para trás da célula IMS a ser armazenada em uma célula de prearray. A partir desta célula de loja de prearray, os íons podem ser ativados e os fragmentos reinjetados na célula IMS para medição de mobilidade de íons, uma abordagem que tem sido usada com sucesso para caracterizar estereomers20. Em última análise, os dados coletados contêm mobilidade de íons e informações m/z para o precursor e seus fragmentos.
Em uma publicação recente que utilizou este desenho cíclico para análises glican (Ollivier et al.21), mostramos que o perfil de mobilidade dos fragmentos contidos nesses dados IMS/IMS age como uma impressão digital de uma biomolécula que pode ser usada em uma estratégia de rede molecular. A rede resultante, chamada IM-MN, levou à organização de conjuntos de dados glicômicos de forma estruturalmente relevante, enquanto a rede construída exclusivamente a partir de dados MS/MS (MS-MN) revelou poucas informações. Para complementar esta publicação e ajudar os usuários do IMS Cíclico a implementar este fluxo de trabalho, este protocolo fornece uma descrição completa do protocolo usado para coletar os dados. Este protocolo se concentra apenas na geração dos dados IMS/IMS que os usuários podem usar para criar redes IM-MN (ver21)— ou para qualquer outra aplicação de sua escolha. A construção do IM-MN não será considerada aqui, pois já existem protocolos para redes moleculares. Destacam-se os pontos cruciais que devem ser seguidos para gerar aquisições valiosas e reprodutíveis do IMS/IMS. Tomando o exemplo de um dos oligossacarídeos estudados por Ollivier et al. 21, as seguintes etapas são detalhadas: (i) preparação da amostra, (ii) ajuste do instrumento IMS Cíclico, (iii) pico automatizado de captação dos dados e (iv) calibração ccs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L- plus 23-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XAXXMIX</td>
			<td>XA2XX + XA3XX mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-&#945;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX)</td>
			<td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td>
			<td>O-XA3XX</td>
			<td>Pure XA3XX standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030120086</td>
			<td>Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm</td>
			<td>Corning Science M&#233;xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td>
			<td>352070</td>
			<td>Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (ACS reagent, &#8805;99 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td>
			<td>310468</td>
			<td>Used to dope the sample with lithium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Mix IMS/Tof Calibration Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186008113</td>
			<td>Calibration solution for MS and IMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>721022377</td>
			<td>Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC PLUS Gradient grade</td>
			<td>Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France</td>
			<td>412383</td>
			<td>High-purity solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Leucine Enkephaline Kit</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>700002456</td>
			<td>Reference compound used for tuning of the mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td>
			<td>218012458</td>
			<td>Used to prepare the solution of 500 &#181;M LiCl in 50:50 MeOH/Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td>
			<td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td>
			<td>186009432</td>
			<td>Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: http://mzmine.github.io/</td>
			<td>MZmine Development Team</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to download the MZmine software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Website: https://github.com/siollivier/IM-MN</td>
			<td>INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France</td>
			<td>-</td>
			<td>Link to an in-house R script containing a CCS calibration function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a cyclic ion mobility spectrometer for tandem ion mobility experiments

A caracterização precisa das estruturas químicas é importante para entender seus mecanismos biológicos subjacentes e propriedades funcionais. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta popular, mas nem sempre é suficiente para desvendar completamente todas as características estruturais. Por exemplo, embora os carboidratos sejam biologicamente relevantes, sua caracterização é complicada por inúmeros níveis de isomerismo. A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante porque é sensível às conformações de íons e, portanto, ao isomerismo. 
Além disso, os avanços recentes melhoraram significativamente a técnica: a última geração de instrumentos IMS cíclicos oferece recursos adicionais em comparação com instrumentos lineares de IMS, como um aumento da potência de resolução ou a possibilidade de realizar experimentos de mobilidade de íons tandem (IMS/IMS). Durante o IMS/IMS, um íon é selecionado com base em sua mobilidade de íons, fragmentado e reanalisado para obter informações sobre mobilidade de íons sobre seus fragmentos. Trabalhos recentes mostraram que os perfis de mobilidade dos fragmentos contidos em tais dados IMS/IMS podem atuar como uma impressão digital de um glicano específico e podem ser usados em uma estratégia de rede molecular para organizar conjuntos de dados glicómicos de forma estruturalmente relevante. 
O objetivo deste protocolo é, portanto, descrever como gerar dados IMS/IMS, desde a preparação da amostra até a calibração final da Seção Transversal de Colisão (CCS) da dimensão de mobilidade de íons que produz espectros reprodutíveis. Tomando o exemplo de um glycan representativo, este protocolo mostrará como construir uma sequência de controle IMS/IMS em um instrumento IMS Cíclico, como explicar essa sequência de controle para traduzir o tempo de chegada do IMS em tempo de deriva (ou seja, o tempo efetivo de separação aplicado aos íons) e como extrair as informações relevantes de mobilidade dos dados brutos. Este protocolo foi projetado para explicar claramente os pontos críticos de um experimento IMS/IMS e, assim, ajudar novos usuários de IMS cíclicos a realizar aquisições simples e reprodutíveis.

Um pentasacarídeo arabinoxylan, XA2XX, foi escolhido como exemplo para ilustrar este protocolo. Este composto está comercialmente disponível, mas apenas como uma mistura com outra pentasacarida arabinoxylan, XA3XX (XA3XX puro também está disponível comercialmente). As estruturas de XA2XX e XA3XX são dadas em Figura Suplementar S1. Como a razão de XA2XX e XA3XX na mistura comercial é ~50:50, uma solução a 20 μg/mL da ...

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Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante à espectrometria de massa para a caracterização de biomoléculas, notadamente por ser sensível ao isomerismo. Este protocolo descreve um experimento tandem IMS (IMS/IMS), que permite o isolamento de uma molécula e a geração dos perfis de mobilidade de seus fragmentos.

Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

O protocolo descreve como registrar um perfil de mobilidade de íons para os fragmentos produzidos após a ativação de uma molécula no espectrômetro de massa, e discriminar entre estruturas isomericas. O protocolo permite que os glicocanos sejam classificados em 11 grupos em relação a algumas de suas principais características estruturais e, assim, forneçam informações de outra forma difíceis de obter. Pode servir para construir redes moleculares que são extremamente genéricas e adequadas para muitas famílias moleculares, como metabólitos ou drogas de interesse em muitas áreas de pesquisa.A abordagem aproveita ao máximo um novo conceito na espectrometria de mobilidade de íons, e será útil onde só a espectrometria de massa não discriminará entre duas estruturas. O experimento requer um bom comando de espectrometria de massa e mobilidade de íons. No entanto, o experimentador deve ser bem sucedido na implementação do método se seguir cuidadosamente cada uma das etapas.Demonstrando o procedimento será Simon Ollivier, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, configure uma sequência IMS de passe único a partir da página Tune, coloque o instrumento no modo Mobility e abra a janela Controle de Sequência Cíclica. Selecione o modo Avançado na guia Funções Cíclicas desta nova janela, selecione Adicionar pacote e, em seguida, Single/Multipass.Aguarde que uma sequência de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência da mesma janela. Adapte a sequência para que todos os íons calibrantes façam uma única passagem ao redor da pista cíclica do IMS. Não altere o tempo de injetar ou o tempo de Ejeção e Adquira, no entanto, reduza o tempo separado para um milissegundo.Se alguns íons da mistura de calibração não se encaixarem na janela de tempo de chegada exibida, altere a sincronização do IMS com o empurrador do analisador TOF de aceleração ortogonal aumentando o número de empurrões por caixa na guia Configurações ADC. Para gravar uma aquisição de dois minutos na janela Controle de Sequência cíclica, clique em Adquirir para abrir a janela pop-up Configurações de aquisição, insira o nome de arquivo, descrição e comprimento de aquisição, minutos e clique em Salvar. Mude o instrumento para o modo TOF a partir da página MS Tune para verificar a estabilidade do sinal.Registoso da aquisição completa da amostra por um minuto, o que será útil para verificar o padrão isotópico e a presença de potenciais contaminantes. Coloque o instrumento no modo MSMS a partir da guia de perfil Quad/MS da página principal de sintonia. Selecione a massa do ferro alvo no campo de massa MSMS para isolamento no quadrupole.Registo uma aquisição de um minuto para verificar o isolamento precursor ao processar os dados. Para executar uma seleção baseada em mobilidade do isômero de interesse, mude o instrumento para o modo Mobilidade na janela Controle de Sequência Cíclica, a partir da guia Funções Cíclicas, selecione Adicionar pacote e, em seguida, fatiamento. Aguarde que uma sequência complexa de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência.Posicione o evento Ejetar e adquirir logo após o primeiro evento Separado e, em seguida, clique em Executar. Procure os resultados da separação inicial a ser exibida em tempo real. Aumente a duração do primeiro evento Separado para uma separação de vários passes alterando o valor de tempo para este evento na sequência até que a resolução dos picos do IMS seja satisfatória.Registo uma aquisição de um minuto para referência. Clique em Pausar, posicione o evento Ejetar e Adquirir abaixo dos eventos Eject, Eject to Pre-Store e Hold e Eject. Ajuste a duração dos eventos de modo que o pico alvo esteja na região do Ejetar para Pré-Loja, e qualquer outro íon esteja na região de Ejetar ou Hold e Ejetar.Posicione o evento Eject and Acquire no final da sequência abaixo do Reinject da Pré-Loja e do segundo Eventos Separados. Clique em Executar para exibir a população selecionada. Verifique a qualidade do isolamento.Registo uma aquisição de um minuto para referência. Na guia Sequência, na coluna ao lado dos horários de evento definidos pelo usuário, procure os tempos resumidos de todos os eventos. Tome nota do Time Abs encontrado na linha do evento Reinject from Pre-Store para realizar a calibração CCS.Defina a duração do evento Separado, procedendo diretamente o Ejeto e a Aquisição em um milissegundo. Na linha Reinject da Pré-Loja, marque a caixa Ativar e otimize a fragmentação com o controle embutido. Se a fragmentação não for satisfatória com o controle embutido, desmarque a caixa de ativação e continue a otimizar manualmente as tensões de reinjeção, aumente o Gradiente Pré-Array e baixe a tensão de deslocamento do array até que os resultados sejam satisfatórios.Para registrar uma aquisição de dois minutos na janela popup Acquisition, marque a opção Reter tempo de deriva para gerar um arquivo contendo apenas os tempos de chegada, contra M sobre Z rotulado como _dt.raw. Após a realização da análise em MS da mistura de pentasacarídeo arabinoxylan, o espectro apresentou um padrão isotópico com um único pico de M sobre z 685,24 sugerindo que os dois compostos são isomericos na natureza. Os adutos dos pentasacarídeos foram separados através da célula IMS cíclica, e três picos foram separados com diferentes tempos de chegada.O XA3XX puro mostra os picos em 83 e 90 milissegundos, enquanto o XA2XX exibe um pico de 94 milissegundos. Após a primeira etapa da separação do IMS, íons pertencentes ao XA3XX foram ejetados, e o pico em 94 milissegundos foi selecionado para análise do IMS-IMS. Uma separação de três passes foi realizada após reinjetar o íon sem ativação, e um pico para XA2XX foi obtido em 199 milissegundos.Os dados gerados do IMS-IMS MS foram desarvolvados usando o tempo de chegada e as dimensões M over Z, gerando o espectro IMS-IMS. Os picos acima de 0,2% de intensidade relativa foram exportados para calibração do CCS, resultando em um espectro IMS-IMS calibrado pelo CCS. É sempre importante verificar o isolamento do íon precursor, caso contrário, o espectro pode vir de uma mistura do composto de juros e dos contaminantes.Anteriormente, usamos espectros IMS-IMS para construir redes e classificar compostos, mas eles também poderiam ser usados para procurar em bancos de dados para identificação de compostos. Esta técnica é muito recente, mas esperamos que seja extremamente útil em glicemias, bem como em qualquer contexto onde os analistas sejam confrontados com moléculas isomeméricas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Caracterização, quantificação e específicos do Composto isotópica Análise de Pirogênica carbono, usando Benzeno policarboxílicos Acids (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Química

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

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Analisando a foto-oxidação do 2-propanol em concentrações de nível de ar interno usando espectrometria de mobilidade do campo Ion assimétrica

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Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

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In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

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Corrosão por imagem na interface metal-Paint usando espectrometria de massa de íons secundários de tempo de voo

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Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica