Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

أجريت هذه الدراسة في مركز دراسة أمراض الميتوكوندريا لدى الأطفال (http://www.mitopedia.org)، بتمويل من مؤسسة مارياني. VT هي عضو في الشبكة المرجعية الأوروبية للأمراض العصبية العضلية النادرة (ERN EURO-NMD).

ملاحظة: قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. تم اشتقاق الخلايا الليفية المستخدمة في هذه الدراسة من مرضى MD وتخزينها في البنك الحيوي المؤسسي وفقا للمتطلبات الأخلاقية. وقدمت الموافقة المستنيرة على استخدام الخلايا. قم بإجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا تحت خزانة تدفق صفا?...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

يحتوي mtDNA على معدل طفرة مرتفع جدا مقارنة ب nDNA بسبب عدم وجود هيستون واقية وموقعه بالقرب من السلسلة التنفسية ، مما يعرض الجزيء لتأثيرات أكسدية ضارة لا تتصدى لها أنظمة الإصلاح بكفاءة16. تم تحديد أول طفرات mtDNA المسببة للأمراض في عام 1988 17,18 ، ومنذ ذلك الحين ، تم وصف ...

اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) هي مجموعة من المتلازمات متعددة الأنظمة الناجمة عن ضعف في وظائف الميتوكوندريا بسبب طفرات في الحمض النووي (nDNA) أو الميتوكوندريا (mtDNA)1. وهي من بين الأمراض الأيضية الموروثة الأكثر شيوعا ، مع انتشار 1: 5000. تتبع الأمراض المرتبطة ب mtDNA قواعد علم الوراثة الميتوكوندريا: وراثة الأم ، وتأثير الغيرية والعتبة ، والفصل الانقسامي2. mtDNA البشري هو دائرة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل من 16.6 كيلو بايت ، والتي تحتوي على منطقة تحكم قصيرة مع تسلسلات اللازمة للتكرار والنسخ ، و 13 جينا ترميز البروتين (جميع الوحدات الفرعية للسلسلة التنفسية) ، و 22 tRNA ، و 2 rRNA الجينات3.
في الأفراد الأصحاء ، هناك نمط وراثي واحد mtDNA (homoplasmy) ، في حين أن أكثر من نمط وراثي واحد يتعايش (heteroplasmy) في الحالات المرضية. يجب أن تتغلب الطفرات غير المتجانسة الضارة على عتبة حرجة لتعطيل OXPHOS والتسبب في أمراض يمكن أن تؤثر على أي عضو في أي عمر4. تملي الوراثة المزدوجة ل OXPHOS الميراث: صبغي جسدي متنحي أو مهيمن ومرتبط ب X لطفرات nDNA ، والأم لطفرات mtDNA ، بالإضافة إلى حالات متفرقة لكل من nDNA و mtDNA.
في بداية عصر طب الميتوكوندريا ، وضعت تجربة تاريخية أجراها كينغ وأتاردي5 الأساس لفهم أصل الطفرة المسؤولة عن MD عن طريق إنشاء خلايا هجينة تحتوي على نوى من خطوط الخلايا السرطانية التي تم فيها استنفاد mtDNA بالكامل (خلايا rho0) والميتوكوندريا من المرضى الذين يعانون من MDs. لم تكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) متاحة في ذلك الوقت ، ولم يكن من السهل تحديد ما إذا كانت هناك طفرة موجودة في الجينوم النووي أو الميتوكوندريا. ثم تم استخدام الطريقة ، الموصوفة في عام 1989 ، من قبل العديد من الباحثين العاملين في مجال طب الميتوكوندريا6،7،8،9. تم نشر بروتوكول مفصل مؤخرا10 ، ولكن لم يتم إنشاء أي فيديو حتى الآن. لماذا يجب أن يكون مثل هذا البروتوكول ذا صلة في الوقت الحاضر عندما يمكن ل NGS تحديد مكان وجود الطفرة بدقة وسرعة؟ الجواب هو أن توليد cybrid لا يزال البروتوكول الحديث لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في mtDNA ، وربط النسبة المئوية للتباين مع شدة المرض ، وإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس تكون فيه مساهمة الخلفية النووية الأصلية للمريض غائبة11 ، 12,13.
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على البلاستيدات الخلوية من الخلايا الليفية المتقاربة المشتقة من المريض والتي تزرع في أطباق بتري 35 ملم. يسمح الطرد المركزي للأطباق في وجود cytochalasin B بعزل الخلايا الخلوية المنوية ، والتي يتم دمجها بعد ذلك مع خلايا rho0 في وجود البولي إيثيلين جلايكول (PEG). ثم تزرع السيبريدات الناتجة في وسط انتقائي حتى تنشأ المستنسخات. يظهر قسم النتائج التمثيلية مثالا على التوصيف الجزيئي للسيبريدات الناتجة لإثبات أن mtDNA مطابق للخلايا الليفية للمرضى المتبرعين وأن nDNA مطابق للحمض النووي لخط خلية rho0 الوراثي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

نقص مجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا التي تنفذ الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) هو العلامة الكيميائية الحيوية لاضطرابات الميتوكوندريا البشرية. من وجهة نظر وراثية ، يمثل OXPHOS مثالا فريدا لأنه ينتج عن استكمال نظامين وراثيين متميزين: الحمض النووي النووي (nDNA) والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). لذلك ، يمكن أن تكون عيوب OXPHOS ناتجة عن طفرات تؤثر على الجينات المشفرة النووية والميتوكوندريا.
أظهر العمل الرائد الذي قام به كينغ وأتاردي ، الذي نشر في عام 1989 ، أن خطوط الخلايا البشرية المستنفدة من mtDNA (المسماة rho0) يمكن إعادة توطينها بواسطة الميتوكوندريا الخارجية للحصول على ما يسمى ب "cybrids transmitochondrial". بفضل هذه السيبريدات التي تحتوي على الميتوكوندريا المشتقة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) والنوى من خلايا rho0 ، من الممكن التحقق مما إذا كان العيب مرتبطا ب mtDNA أو nDNA. هذه السايبريدات هي أيضا أداة قوية للتحقق من صحة إمراض الطفرة ودراسة تأثيرها على المستوى الكيميائي الحيوي. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا يصف توليد السايبرد واختياره وتوصيفه.

يتطلب توليد cybrids 3 أيام من العمل المختبري بالإضافة إلى فترة اختيار (~ 2 أسابيع) و 1-2 أسابيع إضافية لنمو الحيوانات المستنسخة. الخطوات الحاسمة هي جودة cytoplasts وفترة الاختيار. يشبه مورفولوجيا cybrids تلك الموجودة في الخلايا المانحة rho0. تعيين mtDNA الصحيح و nDNA في cybrids إلزامي لتأكيد هوية الخلايا. وير...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

cybrids المتنقلة هي خلايا هجينة يتم الحصول عليها عن طريق دمج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) - الخلايا المستنفدة (خلايا rho0 ) مع الخلايا الخلوية (الخلايا المنوحة) المشتقة من المرضى المصابين باضطرابات الميتوكوندريا. فهي تسمح بتحديد الأصل النووي أو الميتوكوندريا للمرض ، وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي ، وتأكيد الدور الممرض للمتغيرات المرتبطة ب mtDNA.

نهج في المختبر لدراسة خلل الميتوكوندريا: نموذج Cybrid

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

لا يزال التوليد السيبراني هو أحدث بروتوكول لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في الحمض النووي للميتوكوندريا وربط النسبة المئوية للاتروبلاز بشدة المرض. تسمح هذه التقنية بإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس ، حيث تكون مساهمة الخلفية النووية للمريض غائبة. تسمح هذه التقنية بالتحقق من صحة الإمراضية لطفرة في الحمض النووي للميتوكوندريا.ويجعل من الممكن دراسة تأثيره على المستوى الكيميائي الحيوي غسل الأطباق 35 ملم التي تحتوي على الخلايا الليفية مرتين باستخدام ملليلتر من 1X PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. نظف السطح الخارجي للأطباق بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وانتظر حتى يتبخر الكحول. قم بإزالة الأغطية من الأطباق والأغطية اللولبية من الزجاجات.ضع كل طبق بدون الغطاء رأسا على عقب في الجزء السفلي من كل زجاجة طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. أضف ببطء 32 ملليلتر من وسط النوى إلى كل زجاجة مما يسمح للوسط بدخول الطبق وملامسة الخلايا. قم بإزالة أي فقاعات من الأطباق باستخدام ماصة مراعي زجاجية طويلة ، مع تقويس الطرف في لهب بنسن.أغلق كل زجاجة بغطاء المسمار ، وانقلها إلى جهاز الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 8،000 × G.Aspirate الوسط من الزجاجات والتخلص منه. قم بإزالة الأطباق عن طريق عكس الزجاجات على شاش معقم تم رشه مسبقا بالإيثانول بنسبة 70٪.نظف السطح الخارجي للأطباق وأغطيتها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأغلق الأطباق بعد تبخر الإيثانول. قبل المتابعة تحقق من تكوين cytoplast باستخدام المجهر المقلوب للخلايا الحية. ابحث عن الخلايا الليفية الممدودة للغاية بسبب بثق نواتها التي يسببها السيتوكالاسين.لكل طبق 35 ملم إضافة 1،000،143 صف صفر خلايا. أعيد تعليقه في ملليلتر من وسط الثقافة مع استكمال 5٪ FBS. اترك الأطباق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة لتسوية الخلايا الصفرية المكونة من 143 صفا على الأشباح.بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، قم بشفط الوسط والتخلص منه. اغسل خلايا الالتصاق مرتين بملليلتر من وسط الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو MEM ، ثم قم بشفط الوسط والتخلص منه. أضف 500 ميكرولتر من محلول البولي إيثيلين جلايكول إلى الخلايا واحتضنها لمدة دقيقة واحدة بالضبط.شفط والتخلص من محلول البولي إيثيلين جلايكول. اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو مع MEM. أضف ملليلترين من وسط الاندماج ، واحتضن بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.التربسين الخلايا في أطباق الثقافة المتبقية عدها وزرعها في واحد أو أكثر من أطباق بتري أضف 50 إلى 100 خلية لكل طبق في الثقافة المكملة حتى تظهر المستنسخات. ثم دعهم ينمون لعدة أيام. باستخدام مجهر ستيريو ، التقط الحيوانات المستنسخة من طبق بتري باستخدام أسطوانات استنساخ أو طرف ماصة.حاول تجنب تجميع نسخ مختلفة ونقلها إلى طبق بئر 96 ، يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المكملة. تم توليد Cybrids بدءا من الخلايا الليفية المشتقة من مريض يحمل M2343A2G غير المتجانسة واحدة من أكثر طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا شيوعا المرتبطة باعتلال عضلة الميتوكوندريا ، والحماض اللبني الدماغي ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية. أظهر تحليل عدد متغير من التكرارات الترادفية أن الحمض النووي السيبراني مطابق للخلايا الصفرية التي تؤكد استبدال الحمض النووي السيبراني للمريض بجينوم 143 B.يمكن استخدام تعدد الأشكال لطول الشظايا المقيدة ، أو تحليلات التسلسل ، لتقييم وجود طفرة الحمض النووي للميتوكوندريا والنسبة المئوية غير المتجانسة. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم التحقق من الأصل الوراثي الصحيح للحمض النووي للنيوكليون والميتوكوندريا ، وكذلك كمية الحمض النووي للميتوكوندريا في السايبريدات المعاد توطينها.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

متزامنة الفيديو-EEG-ECG الرصد لتحديد الخلل نيوروكاردياك في نماذج الماوس من الصرع

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...