Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Denne undersøgelse blev udført i Center for Studiet af Mitokondrielle Pædiatriske Sygdomme (http://www.mitopedia.org), finansieret af Mariani Foundation. VT er medlem af European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

BEMÆRK: Brug af humane fibroblaster kan kræve etisk godkendelse. Fibroblaster, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev afledt af MS-patienter og opbevaret i den institutionelle biobank i overensstemmelse med etiske krav. Der blev givet informeret samtykke til brugen af cellerne. Udfør alle cellekulturprocedurer under et sterilt laminært flowskab ved stuetemperatur (RT, 22-25 °C). Brug sterilfiltrerede opløsninger, der er egnede til cellekultur og sterilt udstyr. Dyrk alle cellelinjer i en befugtet inkubator ve...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

mtDNA har en meget høj mutationshastighed sammenlignet med nDNA på grund af manglen på beskyttende histoner og dets placering tæt på åndedrætskæden, hvilket udsætter molekylet for skadelige oxidative virkninger, der ikke effektivt modvirkes af reparationssystemerne16. De første patogene mtDNA-mutationer blev identificeret i 198817,18, og siden da er et stort antal mutationer blevet beskrevet. NGS-teknologi er en relevant tilgang ...

Mitokondrielle lidelser (MD'er) er en gruppe af multisystemsyndromer forårsaget af en svækkelse i mitokondrielle funktioner på grund af mutationer i enten nukleart (nDNA) eller mitokondrielt (mtDNA) DNA1. De er blandt de mest almindelige arvelige metaboliske sygdomme med en forekomst på 1:5.000. mtDNA-associerede sygdomme følger reglerne for mitokondriel genetik: moderens arv, heteroplasmi og tærskeleffekt og mitotisk adskillelse2. Humant mtDNA er en dobbeltstrenget DNA-cirkel på 16,6 kb, som indeholder en kort kontrolregion med sekvenser, der er nødvendige for replikation og transkription, 13 proteinkodende gener (alle underenheder i åndedrætskæden), 22 tRNA og 2 rRNA-gener3.
Hos raske individer er der en enkelt mtDNA-genotype (homoplasmi), mens mere end en genotype sameksisterer (heteroplasmi) under patologiske tilstande. Skadelige heteroplasmatiske mutationer skal overvinde en kritisk tærskel for at forstyrre OXPHOS og forårsage sygdomme, der kan påvirke ethvert organ i enhver alderaf 4 år. Den dobbelte genetik af OXPHOS dikterer arv: autosomal recessiv eller dominerende og X-bundet til nDNA-mutationer, moderlig for mtDNA-mutationer plus sporadiske tilfælde både for nDNA og mtDNA.
I begyndelsen af mitokondriemedicinens æra etablerede et skelsættende eksperiment af King og Attardi5 grundlaget for at forstå oprindelsen af en mutation, der er ansvarlig for en MD ved at skabe hybridceller indeholdende kerner fra tumorcellelinjer, hvor mtDNA var helt udtømt (rho0-celler) og mitokondrier fra patienter med MD'er. Næste generations sekventeringsteknikker (NGS) var ikke tilgængelige på det tidspunkt, og det var ikke let at afgøre, om en mutation var til stede i det nukleare eller mitokondrielle genom. Metoden, der blev beskrevet i 1989, blev derefter brugt af flere forskere, der arbejdede inden for mitokondriemedicin 6,7,8,9; en detaljeret protokol er for nylig blevet offentliggjort10, men der er endnu ikke lavet nogen video. Hvorfor skulle en sådan protokol være relevant i dag, når NGS præcist og hurtigt kunne identificere, hvor en mutation er placeret? Svaret er, at cybridgenerering stadig er den nyeste protokol til at forstå den patogene rolle af enhver ny mtDNA-mutation, korrelere procentdelen af heteroplasma med sygdommens sværhedsgrad og udføre en biokemisk undersøgelse i et homogent nukleart system, hvor bidraget fra patientens autoktone nukleare baggrund er fraværende11, 12,13.
Denne protokol beskriver, hvordan man opnår cytoplaster fra sammenflydende, patientafledte fibroblaster dyrket i 35 mm petriskåle. Centrifugering af opvasken i nærvær af cytochalasin B tillader isolering af enukleerede cytoplaster, som derefter smeltes sammen med rho0-celler i nærvær af polyethylenglycol (PEG). De resulterende cybrider dyrkes derefter i selektivt medium, indtil kloner opstår. Afsnittet om repræsentative resultater viser et eksempel på molekylær karakterisering af de resulterende cybrider for at bevise, at mtDNA'et er identisk med donorpatienternes fibroblaster, og at nDNA'et er identisk med det nukleare DNA i den tumorale rho 0-cellelinje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Mangel på mitokondrielle respiratoriske kædekomplekser, der udfører oxidativ phosphorylering (OXPHOS), er den biokemiske markør for humane mitokondrielle lidelser. Fra et genetisk synspunkt repræsenterer OXPHOS et unikt eksempel, fordi det skyldes komplementering af to forskellige genetiske systemer: nukleart DNA (nDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA). Derfor kan OXPHOS-defekter skyldes mutationer, der påvirker nukleare og mitokondrielle kodede gener.
Det banebrydende arbejde af King og Attardi, der blev offentliggjort i 1989, viste, at menneskelige cellelinjer udtømt for mtDNA (kaldet rho0) kunne genbefolkes af eksogene mitokondrier for at opnå de såkaldte "transmitokondrielle cybrider". Takket være disse cybrider, der indeholder mitokondrier afledt af patienter med mitokondrielle lidelser (MD'er) og kerner fra rho0-celler , er det muligt at kontrollere, om en defekt er mtDNA- eller nDNA-relateret. Disse cybrider er også et kraftfuldt værktøj til at validere patogeniciteten af en mutation og studere dens indvirkning på et biokemisk niveau. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, der beskriver cybridgenerering, udvælgelse og karakterisering.

Generering af cybrider kræver 3 dages laboratoriearbejde plus en udvælgelsesperiode (~ 2 uger) og yderligere 1-2 uger til vækst af kloner. De kritiske trin er kvaliteten af cytoplaster og udvælgelsesperioden. Morfologien af cybrider ligner den af rho0 donorcellerne. Tildeling af det korrekte mtDNA og nDNA i cybriderne er obligatorisk for at bekræfte cellernes identitet. Et eksempel er angivet i figur 2. I dette tilfælde genererede vi cybrider startende fra fibroblaster afled...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitokondrielle cybrider er hybridceller opnået ved at fusionere mitokondrie-DNA (mtDNA)-udtømte celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerede celler) afledt af patienter, der er ramt af mitokondrieforstyrrelser. De tillader bestemmelse af sygdommens nukleare eller mitokondrielle oprindelse, evaluering af biokemisk aktivitet og bekræftelse af den patogenetiske rolle af mtDNA-relaterede varianter.

En in vitro-tilgang til undersøgelse af mitokondriel dysfunktion: En cybridmodel

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Cybergenerering er stadig den nyeste protokol til at forstå den patogene rolle af enhver ny mitokondriel DNA-mutation og til at korrelere procentdelen af atriplasmi med sygdommens sværhedsgrad. Denne teknik gør det muligt at udføre biokemisk undersøgelse i et homogent nukleart system, hvor bidraget fra patientens nukleare baggrund er fraværende. Denne teknik gør det muligt at validere patogeniciteten af en mutation af mitokondrie-DNA'et.og gør det muligt at studere dens virkning på biokemisk niveau Vask de 35 millimeter skåle, der indeholder fibroblasterne to gange ved hjælp af to milliliter 1X PBS uden calcium og magnesium. Rengør den ydre overflade af opvasken med 70% ethanol, og vent, indtil alkoholen fordamper. Fjern lågene fra opvasken og skruelågene fra flaskerne.Læg hver skål uden låg på hovedet i bunden af hver 250 ml centrifugeflaske. Tilsæt langsomt 32 ml af et nukleationsmedium til hver flaske, så mediet kan komme ind i fadet og komme i kontakt med cellerne. Fjern eventuelle bobler fra opvasken ved hjælp af en lang glasgræspipette, der buer spidsen i en bunsenflamme.Luk hver flaske med skruelåg, og overfør dem til centrifugen. Centrifuge i 20 minutter ved 37 grader Celsius og 8.000 x G.Aspirer mediet fra flaskerne og kassér det. Fjern opvasken ved at vende flaskerne på en steril gasbind, der tidligere er sprøjtet med 70% ethanol.Rengør den ydre overflade af opvasken og deres låg med 70% ethanol, og luk opvasken, når ethanolen er fordampet. Før du fortsætter, skal du kontrollere for cytoplastdannelse ved hjælp af et omvendt mikroskop til levende celler. Se efter ekstremt aflange fibroblaster på grund af ekstrudering af deres kerner induceret af cytochalasin.Til hver 35 millimeter skål tilsættes 1.000, 143 række nul celler. Re-suspenderet i to milliliter kulturmedium suppleret med 5% FBS. Lad opvasken stå i tre timer i en befugtet kuldioxidinkubator for at afregne de 143 række nulceller på spøgelserne.Efter tre timers inkubation aspirerer og kasserer mediet. Vask adhærenscellerne to gange med to milliliter DMEM højt glucosemedium uden serum eller MEM, derefter aspirere og kassere mediet. Tilsæt 500 mikroliter polyethylenglycolopløsning til cellerne og inkuber i nøjagtigt et minut.Aspirer og kassér polyethylenglycolopløsningen. Vask cellerne tre gange med to milliliter DMEM høj glukose uden serum eller med MEM. Tilsæt to milliliter fusionsmedium, og inkuber natten over i inkubatoren ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Trypsiniser cellerne i de resterende kulturretter Tæl dem og frø dem til en eller flere petriskåle Tilsæt 50 til 100 celler pr. skål i den supplerede kultur, indtil kloner vises. Lad dem derefter vokse i flere dage. Brug et stereomikroskop til at samle klonerne op fra petriskålen med kloningscylindre eller en pipettespids.Prøv at undgå at samle forskellige kloner og overfør dem til en 96 brøndplade, der hver brønd indeholder 200 mikroliter suppleret kulturmedium. Cybrider blev genereret ud fra fibroblaster afledt af en patient, der bærer den heteroplasmatiske M2343A2G En af de mest almindelige mitokondrielle DNA-mutationer forbundet med mitokondriel myopati, encefalopati mælkesyreacidose og slagtilfælde-lignende episoder. Analyse af et variabelt antal tandemgentagelser viste, at cyber-DNA er identisk med række nul-cellerne, hvilket bekræfter udskiftningen af patientens cyber-DNA med 143 B-genomet.Polymorfisme med restriktionsfragmentlængde eller sekventeringsanalyser kan bruges til at vurdere tilstedeværelsen af mitokondrie-DNA-mutationen og heteroplasmiprocenten. Når man forsøger denne protokol, er det vigtigt at verificere det korrekte genetiske aktiv af nukleon og mitokondrie-DNA'et samt mitokondrie-DNA-mængden i de genbefolkede cybrider.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis Elegans - en alsidig In Vivo Model til at studere Host-mikrobe interaktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvågning for at identificere Neurocardiac dysfunktion i musemodeller af epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Et fluorescens-baseret metode til at studere bakteriel RIBOREGULATION i smittet væv

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Brugen af mus mammary tumor celler i en in vitro invasion analyse som et mål for Oncogenic celle adfærd

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...