Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Deze studie werd uitgevoerd in het Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), gefinancierd door de Mariani Foundation. VT is lid van het European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

OPMERKING: Het gebruik van menselijke fibroblasten kan ethische goedkeuring vereisen. Fibroblasten die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van MD-patiënten en opgeslagen in de institutionele biobank in overeenstemming met ethische vereisten. Er werd geïnformeerde toestemming gegeven voor het gebruik van de cellen. Voer alle celkweekprocedures uit onder een steriele laminaire flowkast bij kamertemperatuur (RT, 22-25 °C). Gebruik steriel gefilterde oplossingen die geschikt zijn voor celkweek en steriele appa...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

Het mtDNA heeft een zeer hoge mutatiesnelheid in vergelijking met nDNA vanwege het ontbreken van beschermende histonen en de locatie dicht bij de ademhalingsketen, waardoor het molecuul wordt blootgesteld aan schadelijke oxidatieve effecten die niet efficiënt worden tegengegaan door de reparatiesystemen16. De eerste pathogene mtDNA-mutaties werden geïdentificeerd in 1988 17,18, en sindsdien is een groot aantal mutaties beschreven. NGS-te...

Mitochondriale aandoeningen (MD's) zijn een groep multisysteemsyndromen veroorzaakt door een aantasting van mitochondriale functies als gevolg van mutaties in nucleair (nDNA) of mitochondriaal (mtDNA) DNA1. Ze behoren tot de meest voorkomende erfelijke stofwisselingsziekten, met een prevalentie van 1:5.000. mtDNA-geassocieerde ziekten volgen de regels van mitochondriale genetica: maternale overerving, heteroplasmie en drempeleffect, en mitotische segregatie2. Menselijk mtDNA is een dubbelstrengs DNA-cirkel van 16,6 kb, die een kort controlegebied bevat met sequenties die nodig zijn voor replicatie en transcriptie, 13 eiwitcoderende genen (alle subeenheden van de ademhalingsketen), 22 tRNA en 2 rRNA-genen3.
Bij gezonde personen is er één enkel mtDNA-genotype (homoplasmie), terwijl meer dan één genotype naast elkaar bestaat (heteroplasmie) in pathologische omstandigheden. Schadelijke heteroplasmatische mutaties moeten een kritische drempel overwinnen om OXPHOS te verstoren en ziekten te veroorzaken die elk orgaan op elke leeftijdvan 4 jaar kunnen beïnvloeden. De dubbele genetica van OXPHOS dicteert overerving: autosomaal recessief of dominant en X-gebonden voor nDNA-mutaties, maternale voor mtDNA-mutaties, plus sporadische gevallen zowel voor nDNA als mtDNA.
Aan het begin van het mitochondriale geneeskundetijdperk legde een baanbrekend experiment van King en Attardi5 de basis om de oorsprong van een mutatie die verantwoordelijk is voor een MD te begrijpen door hybride cellen te maken die kernen bevatten uit tumorcellijnen waarin mtDNA volledig was uitgeput (rho0-cellen) en mitochondriën van patiënten met MD's. Next-generation sequencing (NGS) -technieken waren op dat moment niet beschikbaar, en het was niet eenvoudig om te bepalen of een mutatie aanwezig was in het nucleaire of mitochondriale genoom. De methode, beschreven in 1989, werd vervolgens gebruikt door verschillende onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van mitochondriale geneeskunde 6,7,8,9; een gedetailleerd protocol is onlangs gepubliceerd10, maar er is nog geen video gemaakt. Waarom zou zo'n protocol tegenwoordig relevant zijn als NGS precies en snel kan identificeren waar een mutatie zich bevindt? Het antwoord is dat cybridegeneratie nog steeds het state-of-the-art protocol is om de pathogene rol van elke nieuwe mtDNA-mutatie te begrijpen, het percentage heteroplasmie te correleren met de ernst van de ziekte en een biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem waarin de bijdrage van de autochtone nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is11, 12,13.
Dit protocol beschrijft hoe cytoplasten kunnen worden verkregen uit confluente, patiënt-afgeleide fibroblasten gekweekt in 35 mm petrischalen. Centrifugering van de schotels in aanwezigheid van cytochalasine B maakt de isolatie van enucleated cytoplasten mogelijk, die vervolgens worden gefuseerd met rho0-cellen in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG). De resulterende cybriden worden vervolgens gekweekt in selectief medium totdat er klonen ontstaan. De sectie met representatieve resultaten toont een voorbeeld van moleculaire karakterisering van de resulterende cybriden om te bewijzen dat het mtDNA identiek is aan dat van de fibroblasten van de donorpatiënten en dat het nDNA identiek is aan het nucleaire DNA van de tumorale rho 0-cellijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Deficiëntie van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen die oxidatieve fosforylering (OXPHOS) uitvoeren, is de biochemische marker van menselijke mitochondriale aandoeningen. Vanuit genetisch oogpunt is het OXPHOS een uniek voorbeeld omdat het het resultaat is van de aanvulling van twee verschillende genetische systemen: nucleair DNA (nDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA). Daarom kunnen OXPHOS-defecten te wijten zijn aan mutaties die nucleaire en mitochondriale gecodeerde genen beïnvloeden.
Het baanbrekende werk van King en Attardi, gepubliceerd in 1989, toonde aan dat menselijke cellijnen uitgeput van mtDNA (genaamd rho0) opnieuw kunnen worden bevolkt door exogene mitochondriën om de zogenaamde "transmitochondrial cybrids" te verkrijgen. Dankzij deze cybriden die mitochondriën bevatten die afkomstig zijn van patiënten met mitochondriale aandoeningen (MD's) en kernen van rho0-cellen , is het mogelijk om te verifiëren of een defect mtDNA- of nDNA-gerelateerd is. Deze cybriden zijn ook een krachtig hulpmiddel om de pathogeniciteit van een mutatie te valideren en de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol dat cybridegeneratie, selectie en karakterisering beschrijft.

Het genereren van cybriden vereist 3 dagen laboratoriumwerk plus een selectieperiode (~ 2 weken) en extra 1-2 weken voor de groei van klonen. De kritische stappen zijn de kwaliteit van cytoplasten en de selectieperiode. De morfologie van cybriden lijkt op die van de rho0 donorcellen. Toewijzing van het juiste mtDNA en nDNA in de cybriden is verplicht om de identiteit van de cellen te bevestigen. Een voorbeeld is te zien in figuur 2. In dit geval genereerden we cybriden vanaf fibro...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.

Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Cybergeneratie is nog steeds het state-of-the-art protocol om de pathogene rol van elke nieuwe mitochondriale DNA-mutatie te begrijpen en het percentage atriplasmie te correleren met de ernst van de ziekte. Deze techniek maakt het mogelijk biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem, waarbij de bijdrage van de nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is. Deze techniek maakt het mogelijk om de pathogeniciteit van een mutatie van het mitochondriale DNA te valideren.en maakt het mogelijk om de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen Was de 35 millimeter schotels met de fibroblasten tweemaal met behulp van twee milliliter 1X PBS zonder calcium en magnesium. Reinig het buitenoppervlak van de vaat met 70% ethanol en wacht tot de alcohol verdampt. Verwijder de deksels van de vaat en de schroefdoppen van de flessen.Plaats elke schaal zonder deksel ondersteboven op de bodem van elke centrifugefles van 250 milliliter. Voeg langzaam 32 milliliter van een nucleatiemedium toe aan elke fles, zodat het medium de schaal kan binnendringen en in contact kan komen met de cellen. Verwijder eventuele bubbels uit de gerechten met een lange glazen weidepipet en buig de punt in een bunsenvlam.Sluit elke fles met de schroefdop en breng ze over naar de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 8.000 x G.Zuig het medium uit de flessen en gooi het weg. Verwijder de gerechten door de flessen om te keren op een steriel gaasje dat eerder met 70% ethanol is besproeid.Reinig het buitenoppervlak van de vaat en hun deksels met 70% ethanol en sluit de vaat nadat de ethanol is verdampt. Controleer voordat u verder gaat op cytoplastvorming met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen. Zoek naar extreem langwerpige fibroblasten als gevolg van de extrusie van hun kernen geïnduceerd door cytochalasine.Voeg aan elke schotel van 35 millimeter 1.000. 143 rij nulcellen toe. Opnieuw gesuspendeerd in twee milliliter kweekmedium aangevuld met 5%FBS. Laat de gerechten drie uur in een bevochtigde kooldioxide-incubator om de 143 rijen nulcellen op de geesten te laten bezinken.Na drie uur incubatie, aspirateer en gooi het medium weg. Was de hechtingscellen tweemaal met twee milliliter DMEM-medium met hoge glucose zonder serum of MEM, aspiraleer vervolgens en gooi het medium weg. Voeg 500 microliter polyethyleenglycoloplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende precies één minuut.Aspirateer en gooi de polyethyleenglycoloplossing weg. Was de cellen driemaal met twee milliliter DMEM hoge glucose zonder serum of met MEM. Voeg twee milliliter fusiemedium toe en incubeer een nacht in de incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Trypsinize de cellen in de resterende kweekschalen Tel ze en zaai ze in een of meer petrischalen Voeg 50 tot 100 cellen per schaal toe in de aangevulde cultuur totdat er klonen verschijnen. Laat ze dan enkele dagen groeien. Pak met een stereomicroscoop de klonen uit de petrischaal met klooncilinders of een pipetpunt.Probeer te voorkomen dat verschillende klonen worden samengevoegd en breng ze over naar een plaat van 96 putten, elk met 200 microliter aangevuld kweekmedium. Cybriden werden gegenereerd vanaf fibroblasten afgeleid van een patiënt die de heteroplasmatische M2343A2G droeg Een van de meest voorkomende mitochondriale DNA-mutaties geassocieerd met mitochondriale myopathie, encefalopathie lactaatacidose en beroerte-achtige episodes. Analyse van een variabel aantal tandemherhalingen toonde aan dat cyber-DNA identiek is aan de rij nulcellen die de vervanging van het cyber-DNA van de patiënt door het 143 B-genoom bevestigen.Restrictiefragmentlengte polymorfisme, of sequencinganalyses, kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van de mitochondriale DNA-mutatie en het heteroplasmiepercentage te beoordelen. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om de juiste genetische troef van het nucleon en mitochondriaal DNA te verifiëren, evenals de mitochondriale DNA-hoeveelheid in de herbevolkte cybriden.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Gelijktijdige Video-EEG-ECG controle om te identificeren Neurocardiac dysfunctie in muismodellen van epilepsie

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...