Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
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Diese Studie wurde im Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org) durchgeführt, das von der Mariani Foundation finanziert wird. VT ist Mitglied des European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

HINWEIS: Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten Fibroblasten wurden von MD-Patienten abgeleitet und in der institutionellen Biobank in Übereinstimmung mit ethischen Anforderungen gespeichert. Für die Nutzung der Zellen wurde eine Einwilligung nach Aufklärung erteilt. Führen Sie alle Zellkulturverfahren unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank bei Raumtemperatur (RT, 22-25 °C) durch. Verwenden Sie steril gefilterte Lösungen, die für Zellk...

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	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. 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J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

Die mtDNA hat eine sehr hohe Mutationsrate im Vergleich zu nDNA aufgrund des Mangels an schützenden Histonen und ihrer Lage in der Nähe der Atmungskette, die das Molekül schädlichen oxidativen Effekten aussetzt, denen die Reparatursysteme nicht wirksam entgegenwirken16. Die ersten pathogenen mtDNA-Mutationen wurden1988 identifiziert 17,18, und seitdem wurde eine große Anzahl von Mutationen beschrieben. Die NGS-Technologie ist ein rele...

Mitochondriale Störungen (MDs) sind eine Gruppe von Multisystemsyndromen, die durch eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen aufgrund von Mutationen entweder in der Kern- (nDNA) oder der mitochondrialen (mtDNA) DNA1 verursacht werden. Sie gehören mit einer Prävalenz von 1:5.000 zu den häufigsten vererbten Stoffwechselerkrankungen. mtDNA-assoziierte Erkrankungen folgen den Regeln der mitochondrialen Genetik: mütterliche Vererbung, Heteroplasmie und Schwelleneffekt sowie mitotische Segregation2. Human mtDNA ist ein doppelsträngiger DNA-Kreis von 16,6 kb, der eine kurze Kontrollregion mit Sequenzen enthält, die für die Replikation und Transkription benötigt werden, 13 proteinkodierende Gene (alle Untereinheiten der Atmungskette), 22 tRNA und 2 rRNA-Gene3.
Bei gesunden Personen gibt es einen einzigen mtDNA-Genotyp (Homoplasmatik), während mehr als ein Genotyp unter pathologischen Zuständen koexistiert (Heteroplasmie). Schädliche heteroplasmatische Mutationen müssen eine kritische Schwelle überwinden, um OXPHOS zu stören und Krankheiten zu verursachen, die jedes Organ in jedem Alterbetreffen können 4. Die duale Genetik von OXPHOS diktiert die Vererbung: autosomal-rezessiv oder dominant und X-chromosomal für nDNA-Mutationen, mütterlich für mtDNA-Mutationen sowie sporadische Fälle sowohl für nDNA als auch für mtDNA.
Zu Beginn der Ära der mitochondrialen Medizin schuf ein bahnbrechendes Experiment von King und Attardi5 die Grundlage, um den Ursprung einer Mutation zu verstehen, die für einen MD verantwortlich ist, indem Hybridzellen geschaffen wurden, die Kerne aus Tumorzelllinien enthielten, in denen mtDNA vollständig erschöpft war (rho 0-Zellen) und Mitochondrien von Patienten mit MDs. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar. Und es war nicht einfach festzustellen, ob eine Mutation im nuklearen oder mitochondrialen Genom vorhanden war. Die 1989 beschriebene Methode wurde dann von mehreren Forschern verwendet, die auf dem Gebiet der mitochondrialen Medizin arbeiteten 6,7,8,9; Ein detailliertes Protokoll wurde kürzlichveröffentlicht 10, aber es wurde noch kein Video gemacht. Warum sollte ein solches Protokoll heutzutage relevant sein, wenn NGS genau und schnell identifizieren könnte, wo sich eine Mutation befindet? Die Antwort ist, dass die Cybrid-Erzeugung immer noch das State-of-the-Art-Protokoll ist, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mtDNA-Mutation zu verstehen, den Prozentsatz der Heteroplasmie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren und eine biochemische Untersuchung in einem homogenen Kernsystem durchzuführen, in dem der Beitrag des autochthonen nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt11, 12,13
Dieses Protokoll beschreibt, wie man Zytoplasten aus konfluierenden, von Patienten abgeleiteten Fibroblasten erhält, die in 35-mm-Petrischalen gezüchtet werden. Die Zentrifugation der Schalen in Gegenwart von Cytochalasin B ermöglicht die Isolierung von enukleierten Zytoplasten, die dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit Rho-0-Zellen verschmolzen werden. Die resultierenden Cybriden werden dann in selektivem Medium kultiviert, bis Klone entstehen. Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zeigt ein Beispiel für die molekulare Charakterisierung der resultierenden Cybrids, um zu beweisen, dass die mtDNA mit der der Fibroblasten der Spenderpatienten identisch ist und dass die nDNA mit der Kern-DNA der tumoralenRho-0-Zelllinie identisch ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Der Mangel an den mitochondrialen Atmungskettenkomplexen, die eine oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) durchführen, ist der biochemische Marker für mitochondriale Erkrankungen beim Menschen. Aus genetischer Sicht stellt der OXPHOS ein einzigartiges Beispiel dar, da er aus der Komplementarität zweier unterschiedlicher genetischer Systeme resultiert: Kern-DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA). Daher können OXPHOS-Defekte auf Mutationen zurückzuführen sein, die nukleäre und mitochondriale kodierte Gene betreffen.
Die bahnbrechende Arbeit von King und Attardi, die 1989 veröffentlicht wurde, zeigte, dass menschliche Zelllinien, die von mtDNA (genannt Rho0) erschöpft waren, von exogenen Mitochondrien wieder besiedelt werden konnten, um die sogenannten "transmitochondrialen Cybrids" zu erhalten. Dank dieser Cybriden, die Mitochondrien enthalten, die von Patienten mit mitochondrialen Störungen (MDs) und Kernen ausRho-0-Zellen stammen, kann überprüft werden, ob ein Defekt mtDNA- oder nDNA-bezogen ist. Diese Cybriden sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Pathogenität einer Mutation zu validieren und ihre Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das die Generierung, Auswahl und Charakterisierung von Cybrid beschreibt.

Die Erzeugung von Cybriden erfordert 3 Tage Laborarbeit plus eine Selektionszeit (~ 2 Wochen) und zusätzliche 1-2 Wochen für das Wachstum von Klonen. Die kritischen Schritte sind die Qualität der Zytoplasten und der Selektionszeitraum. Die Morphologie der Cybriden ähnelt der derrho-0-Spenderzellen. Die Zuordnung der korrekten mtDNA und nDNA in den Cybriden ist zwingend erforderlich, um die Identität der Zellen zu bestätigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 dargestellt. In di...

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An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.

Ein In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion: Ein Cybrid-Modell

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Cyber-Generierung ist immer noch das State-of-the-Art-Protokoll, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mitochondrialen DNA-Mutation zu verstehen und den Prozentsatz der Atriplassie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Diese Technik ermöglicht die Durchführung biochemischer Untersuchungen in einem homogenen Kernsystem, in dem der Beitrag des nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt. Diese Technik ermöglicht die Validierung der Pathogenität einer Mutation der mitochondrialen DNA.und ermöglicht es, seine Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen Waschen Sie das 35-Millimeter-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit zwei Millilitern 1X PBS ohne Kalzium und Magnesium. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet. Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen.Stellen Sie jede Schale ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250-Milliliter-Zentrifugenflasche. Fügen Sie langsam 32 Milliliter eines Keimbildungsmediums zu jeder Flasche hinzu, damit das Medium in die Schale gelangen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen vom Geschirr mit einer langen Glaspipette und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.Schließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge. Zentrifen Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 8.000 x G.Saugen Sie das Medium aus den Flaschen und entsorgen Sie es. Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde.Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol und schließen Sie das Geschirr, nachdem das Ethanol verdunstet ist. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplastenbildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen. Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin induziert werden.Fügen Sie zu jeder 35-Millimeter-Schale 1.000, 143 Zeilennullzellen hinzu. Resuspendiert in zwei Millilitern Kulturmedium, ergänzt mit 5% FBS. Lassen Sie das Geschirr drei Stunden in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator, um die 143 Reihen-Null-Zellen auf den Geistern zu besiedeln.Nach drei Stunden Inkubation das Medium absaugen und entsorgen. Waschen Sie die Adhärenzzellen zweimal mit zwei Millilitern DMEM-hohem Glukosemedium ohne Serum oder MEM, dann aspirieren und verwerfen Sie das Medium. Geben Sie 500 Mikroliter Polyethylenglykollösung in die Zellen und inkubieren Sie für genau eine Minute.Saugen Sie die Polyethylenglykollösung ab und verwerfen Sie sie. Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM. Fügen Sie zwei Milliliter Fusionsmedium hinzu und inkubieren Sie über Nacht im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen Zählen Sie sie und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen Fügen Sie 50 bis 100 Zellen pro Schale in die ergänzte Kultur ein, bis Klone erscheinen. Dann lassen Sie sie mehrere Tage wachsen. Nehmen Sie mit einem Stereomikroskop die Klone mit Klonflaschen oder einer Pipettenspitze aus der Petrischale auf.Versuchen Sie, das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 Mikroliter ergänztes Kulturmedium enthält. Cybrids wurden ausgehend von Fibroblasten erzeugt, die von einem Patienten abgeleitet wurden, der den heteroplasmatischen M2343A2G trug Eine der häufigsten mitochondrialen DNA-Mutationen, die mit mitochondrialer Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden assoziiert sind. Die Analyse einer variablen Anzahl von Tandemwiederholungen zeigte, dass Cyber-DNA mit den Zellen der Reihe Null identisch ist, was den Ersatz der Cyber-DNA des Patienten durch das 143 B-Genom bestätigt.Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus oder Sequenzierungsanalysen können verwendet werden, um das Vorhandensein der mitochondrialen DNA-Mutation und den Heteroplasmieprozentsatz zu beurteilen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, das korrekte genetische Asset des Nukleons und der mitochondrialen DNA sowie die mitochondriale DNA-Menge in den wiederbesiedelten Cybriden zu überprüfen.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

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Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Forschung

Genetik

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

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DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

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Gleichzeitige Video-EEG-EKG Monitoring Neurocardiac Dysfunktion in Mausmodellen der Epilepsie zu identifizieren

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Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

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Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

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