Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

מחקר זה בוצע במרכז לחקר מחלות ילדים מיטוכונדריאליות (http://www.mitopedia.org), במימון קרן מריאני. VT הוא חבר ברשת הייחוס האירופית למחלות נוירומוסקולריות נדירות (ERN EURO-NMD).

הערה: השימוש בפיברובלסטים אנושיים עשוי לדרוש אישור אתי. פיברובלסטים ששימשו במחקר זה נגזרו מחולי MD ואוחסנו בבנק הביולוגי המוסדי בהתאם לדרישות האתיות. ניתנה הסכמה מדעת לשימוש בתאים. בצע את כל ההליכים של תרבית תאים תחת ארון זרימה למינרי סטרילי בטמפרטורת החדר (RT, 22-25 °C (22-25 °C).22°C). השתמשו בתמיס?...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

ל-mtDNA יש שיעור מוטציות גבוה מאוד בהשוואה ל-nDNA בגלל היעדר היסטונים מגנים ומיקומה קרוב לשרשרת הנשימה, מה שחושף את המולקולה להשפעות חמצון מזיקות שאינן מנוגדות ביעילות על ידי מערכות התיקון16. המוטציות הפתוגניות הראשונות של mtDNA זוהו בשנת 198817,18, ומאז ת...

הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) הן קבוצה של תסמונות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי פגיעה בתפקודים המיטוכונדריאליים עקב מוטציות בדנ"א גרעיני (nDNA) או במיטוכונדריאלי (mtDNA)1. הם בין המחלות המטבוליות התורשתיות הנפוצות ביותר, עם שכיחות של 1:5,000. מחלות הקשורות ל- mtDNA עוקבות אחר הכללים של גנטיקה מיטוכונדריאלית: תורשה אימהית, הטרופלזמה ואפקט סף, והפרדה מיטוטית2. mtDNA אנושי הוא מעגל דנ"א דו-גדילי של 16.6 קילובייט, המכיל אזור בקרה קצר עם רצפים הדרושים לשכפול ושעתוק, 13 גנים המקודדים חלבונים (כולם תת-יחידות של שרשרת הנשימה), 22 tRNA ו-2 גנים rRNA3.
אצל אנשים בריאים, יש גנוטיפ mtDNA אחד ויחיד (homoplasmy), בעוד שיותר מגנוטיפ אחד מתקיים בדו-קיום (הטרופלזמה) בתנאים פתולוגיים. מוטציות הטרופלסמיות מזיקות חייבות להתגבר על סף קריטי כדי לשבש OXPHOS ולגרום למחלות שיכולות להשפיע על כל איבר בכל איבר בכל גיל4. הגנטיקה הכפולה של OXPHOS מכתיבה תורשה: אוטוזומלית רצסיבית או דומיננטית ומקושרת X למוטציות nDNA, אימהית למוטציות mtDNA, בתוספת מקרים ספורדיים הן עבור nDNA והן עבור mtDNA.
בתחילת עידן הרפואה המיטוכונדרית, ניסוי פורץ דרך של קינג ואטארדי5 ביסס את הבסיס להבנת מקורה של מוטציה האחראית על MD על ידי יצירת תאים היברידיים המכילים גרעינים מקווי תאים סרטניים שבהם mtDNA התרוקן לחלוטין (תאי rho0) ומיטוכונדריה מחולים עם MDs. טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS) לא היו זמינות באותה תקופה, ולא היה קל לקבוע אם מוטציה קיימת בגנום הגרעיני או המיטוכונדריאלי. השיטה, שתוארה בשנת 1989, שימשה אז כמה חוקרים שעבדו בתחום הרפואה המיטוכונדרית 6,7,8,9; פרוטוקול מפורט פורסם לאחרונה10, אך עדיין לא נעשה סרטון. מדוע פרוטוקול כזה צריך להיות רלוונטי בימינו כאשר NGS יכול לזהות במדויק ובמהירות היכן נמצאת מוטציה? התשובה היא שדור cybrid הוא עדיין הפרוטוקול החדיש ביותר כדי להבין את התפקיד הפתוגני של כל מוטציה mtDNA חדשה, לתאם את אחוז ההטרופלזמה עם חומרת המחלה, ולבצע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית שבה התרומה של הרקע הגרעיני האוטוכטוני של המטופל נעדרת11, 12,13.
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג ציטופלסטים מפיברובלסטים קונפלואנטיים שמקורם בחולים הגדלים בצלחות פטרי 35 מ"מ. צנטריפוגה של הכלים בנוכחות ציטוכלאסין B מאפשרת בידוד של ציטופלסטים משועבדים, אשר לאחר מכן מתמזגים עם תאי rho0 בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG). לאחר מכן מטפחים את הציברידים המתקבלים בתווך סלקטיבי עד שנוצרים שיבוטים. סעיף התוצאות הייצוגיות מציג דוגמה לאפיון מולקולרי של הציברידים המתקבלים כדי להוכיח כי ה-mtDNA זהה לזה של הפיברובלסטים של המטופלים התורמים וכי ה-nDNA זהה לדנ"א הגרעיני של קו תאי ה-rho0 הגידולי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

מחסור בקומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית המבצעים זרחון חמצוני (OXPHOS) הוא הסמן הביוכימי של הפרעות מיטוכונדריאליות אנושיות. מנקודת מבט גנטית, ה-OXPHOS מהווה דוגמה ייחודית משום שהוא נובע מהשלמה של שתי מערכות גנטיות נפרדות: דנ"א גרעיני (nDNA) ודנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA). לכן, פגמים ב-OXPHOS יכולים לנבוע ממוטציות המשפיעות על גנים מקודדים גרעיניים ומיטוכונדריאליים.
עבודתם פורצת הדרך של קינג ואטארדי, שפורסמה ב-1989, הראתה כי קווי תאים אנושיים שהתרוקנו מ-mtDNA (הנקראים rho0) יכולים להיות מאוכלסים מחדש על ידי מיטוכונדריה אקסוגנית כדי להשיג את מה שמכונה "ציברידים טרנסטרוכונדריאליים". הודות לציברידים אלה המכילים מיטוכונדריה שמקורם בחולים עם הפרעות מיטוכונדריאליות (MDs) וגרעינים מתאי rho0 , ניתן לוודא אם פגם קשור ל-mtDNA או ל-nDNA. cybrids אלה הם גם כלי רב עוצמה כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציה ולחקור את השפעתה ברמה ביוכימית. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט המתאר יצירת cybrid, בחירה ואפיון.

יצירת cybrids דורשת 3 ימים של עבודת מעבדה בתוספת תקופת בחירה (~ 2 שבועות) ועוד 1-2 שבועות לצמיחת שיבוטים. השלבים הקריטיים הם איכות הציטופלסטים ותקופת הבחירה. המורפולוגיה של cybrids דומה לזו של התאים התורמים rho0. הקצאה של mtDNA ו- nDNA הנכונים ב- cybrids היא חובה כדי לאשר את זהות התאים. דוגמה לכך ניתנת <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

ציברידים טרנסברוכונדריאליים הם תאים היברידיים המתקבלים על ידי התמזגות של תאים מיטוכונדריאליים מיטוכונדריאליים (mtDNA) מדולדלים (תאי rho0 ) עם ציטופלסטים (תאים מלוכדים) שמקורם בחולים הסובלים מהפרעות מיטוכונדריאליות. הם מאפשרים לקבוע את המקור הגרעיני או המיטוכונדריאלי של המחלה, הערכה של פעילות ביוכימית, ואישור של התפקיד הפתוגנטי של גרסאות הקשורות ל- mtDNA.

גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

יצירת סייבר היא עדיין הפרוטוקול המשוכלל להבנת התפקיד הפתוגני של כל מוטציה חדשה בדנ"א המיטוכונדריאלי ולתאמות את אחוז האטריפלסמיה לחומרת המחלה. טכניקה זו מאפשרת ביצוע חקירה ביוכימית במערכת גרעינית הומוגנית, שבה נעדרת תרומת הרקע הגרעיני של המטופל. טכניקה זו מאפשרת לאמת את הפתוגניות של מוטציה של הדנ"א המיטוכונדריאלי.ומאפשר לחקור את השפעתו ברמה הביוכימית לשטוף את הכלים 35 מילימטר המכילים את הפיברובלסטים פעמיים באמצעות שני מיליליטרים של 1X PBS ללא סידן ומגנזיום. מנקים את המשטח החיצוני של הכלים עם 70% אתנול, ומחכים עד שהאלכוהול יתאדה. מוציאים את המכסים מהכלים ואת פקקי הברגים מהבקבוקים.מניחים כל מנה ללא המכסה הפוך בתחתית כל בקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר. לאט לאט מוסיפים 32 מיליליטרים של מדיום נוקלאציה לכל בקבוק ומאפשרים למדיום להיכנס לצלחת ולבוא במגע עם התאים. מוציאים את כל הבועות מהכלים באמצעות פיפטת מרעה ארוכה מזכוכית, ומעוגלים את הקצה בלהבת בונזן.סגור כל בקבוק עם פקק הבורג, והעביר אותם לצנטריפוגה. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 8, 000 x G.לשאוף את המדיום מן הבקבוקים ולהשליך אותו. מוציאים את הכלים על ידי היפוך הבקבוקים על גזה סטרילית שרוססה בעבר ב-70% אתנול.נקו את המשטח החיצוני של הכלים והמכסים שלהם ב-70% אתנול, וסגרו את הכלים לאחר שהאתנול מתאדה. לפני שנמשיך לבדוק היווצרות ציטופלסט באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור תאים חיים. חפשו פיברובלסטים מוארכים במיוחד עקב שחול של הגרעינים שלהם המושרה על ידי ציטוכלאסין.לכל מנה של 35 מילימטר מוסיפים 1, 000, 143 שורות אפס תאים. מושעה מחדש בשני מיליליטרים של מדיום תרבית בתוספת 5% FBS. השאירו את הכלים במשך שלוש שעות באינקובטור פחמן דו-חמצני לח כדי ליישב את 143 תאי האפס בשורה על רוחות הרפאים.לאחר שלוש שעות של דגירה, לשאוף ולהשליך את המדיום. לשטוף את תאי הדבקות פעמיים עם שני מיליליטרים של מדיום גלוקוז גבוה DMEM ללא סרום או MEM, ואז לשאוף ולהשליך את המדיום. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת פוליאתילן גליקול לתאים ודגירו למשך דקה אחת בדיוק.לשאוף ולהשליך את תמיסת הפוליאתילן גליקול. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של DMEM גלוקוז גבוה ללא סרום או עם MEM. מוסיפים שני מיליליטרים של מדיום היתוך, ומחממים לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.נסו את התאים במנות התרבית הנותרות ספרו אותם וזרעו אותם לצלחות פטרי אחת או יותר הוסיפו 50 עד 100 תאים למנה בתרבית התוסף עד להופעת שיבוטים. אז תן להם לגדול במשך כמה ימים. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, הרימו את השיבוטים מצלחת פטרי עם גלילי שיבוט או קצה פיפטה.נסו להימנע מאגום שיבוטים שונים ולהעביר אותם לצלחת 96 באר, שכל באר מכילה 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית משלים. Cybrids נוצרו החל מפיברובלסטים שמקורם בחולה שנשא את M2343A2G ההטרופלסמי אחת ממוטציות הדנ"א המיטוכונדריה הנפוצות ביותר הקשורות למיופתיה מיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה חומצה לקטית ואפיזודות דמויות שבץ. ניתוח של מספר משתנה של חזרות טנדם הראה כי דנ"א סייבר זהה לתאי האפס בשורה המאשרים את החלפת הדנ"א הקיברנטי של המטופל בגנום 143 B.ניתן להשתמש בפולימורפיזם של אורך מקטע הגבלה, או בניתוחי ריצוף, כדי להעריך את נוכחותה של מוטציית הדנ"א המיטוכונדריאלי ואת אחוז ההטרופלזמה. כאשר מנסים פרוטוקול זה חשוב לאמת את הנכס הגנטי הנכון של הדנ"א הנוקליאון והמיטוכונדריאלי, כמו גם את כמות הדנ"א המיטוכונדריאלי בציברידים המאוכלסים מחדש.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

סימולטני וידאו-EEG-אק ג ניטור כדי לזהות Neurocardiac בתפקוד במודלים של העכבר של אפילפסיה

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...