Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Questo studio è stato condotto nel Centro per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche (http://www.mitopedia.org), finanziato dalla Fondazione Mariani. VT è membro dell'European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

NOTA: L'uso di fibroblasti umani può richiedere l'approvazione etica. I fibroblasti utilizzati in questo studio sono stati derivati da pazienti con MD e conservati nella biobanca istituzionale in conformità con i requisiti etici. È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare sterile a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilizzare soluzioni filtrate sterili adatte per colture cellulari e apparecchiature sterili. Far cre...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

Il mtDNA ha un tasso di mutazione molto elevato rispetto all'nDNA a causa della mancanza di istoni protettivi e della sua posizione vicino alla catena respiratoria, che espone la molecola a dannosi effetti ossidativi non efficacemente contrastati dai sistemi di riparazione16. Le prime mutazioni patogenetiche del mtDNA sono state identificate nel 198817,18 e da allora è stato descritto un gran numero di mutazioni. La tecnologia NGS è un a...

I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA1 nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica2. Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni codificanti proteine (tutte le subunità della catena respiratoria), 22 tRNA e 2 geni rRNA3.
Negli individui sani, esiste un singolo genotipo di mtDNA (omoplasmia), mentre più di un genotipo coesiste (eteroplasmia) in condizioni patologiche. Le mutazioni eteroplasmatiche deleterie devono superare una soglia critica per interrompere OXPHOS e causare malattie che possono colpire qualsiasi organo a qualsiasi etàdi 4 anni. La duplice genetica di OXPHOS determina la trasmissione: autosomica recessiva o dominante e legata all'X per le mutazioni del nDNA, materna per le mutazioni del mtDNA, più casi sporadici sia per nDNA che per mtDNA.
All'inizio dell'era della medicina mitocondriale, un esperimento storico di King e Attardi5 ha stabilito le basi per comprendere l'origine di una mutazione responsabile di una MD creando cellule ibride contenenti nuclei da linee cellulari tumorali in cui il mtDNA era completamente impoverito (cellule rho0) e mitocondri da pazienti con MD. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) non erano disponibili in quel momento, e non è stato facile determinare se una mutazione fosse presente nel genoma nucleare o mitocondriale. Il metodo, descritto nel 1989, è stato poi utilizzato da diversi ricercatori che lavorano nel campo della medicina mitocondriale 6,7,8,9; un protocollo dettagliato è stato recentemente pubblicato10, ma nessun video è stato ancora realizzato. Perché un tale protocollo dovrebbe essere rilevante al giorno d'oggi quando NGS potrebbe identificare in modo preciso e rapido dove si trova una mutazione? La risposta è che la generazione di cibridi è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del mtDNA, correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia ed eseguire un'indagine biochimica in un sistema nucleare omogeneo in cui il contributo del background nucleare autoctono del paziente è assente11, 12,13.
Questo protocollo descrive come ottenere citoplasti da fibroblasti confluenti derivati dal paziente coltivati in piastre di Petri da 35 mm. La centrifugazione delle piastre in presenza di citocalasina B consente l'isolamento di citoplasti enucleati, che vengono poi fusi con cellule rho0 in presenza di polietilenglicole (PEG). I cibridi risultanti vengono quindi coltivati in mezzo selettivo fino a quando non sorgono cloni. La sezione dei risultati rappresentativi mostra un esempio di caratterizzazione molecolare dei cibridi risultanti per dimostrare che il mtDNA è identico a quello dei fibroblasti dei pazienti donatori e che l'nDNA è identico al DNA nucleare della linea cellulare tumorale rho0 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

La carenza dei complessi della catena respiratoria mitocondriale che effettuano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è il marcatore biochimico dei disturbi mitocondriali umani. Da un punto di vista genetico, l'OXPHOS rappresenta un esempio unico perché deriva dalla complementazione di due sistemi genetici distinti: il DNA nucleare (nDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA). Pertanto, i difetti di OXPHOS possono essere dovuti a mutazioni che colpiscono i geni codificati nucleari e mitocondriali.
Il lavoro pionieristico di King e Attardi, pubblicato nel 1989, ha dimostrato che le linee cellulari umane impoverite di mtDNA (chiamato rho0) potrebbero essere ripopolate dai mitocondri esogeni per ottenere i cosiddetti "cibridi transmitocondriali". Grazie a questi cibridi contenenti mitocondri derivati da pazienti con disturbi mitocondriali (MD) e nuclei da cellule rho0 , è possibile verificare se un difetto è correlato al mtDNA o all'nDNA. Questi cibridi sono anche un potente strumento per convalidare la patogenicità di una mutazione e studiarne l'impatto a livello biochimico. Questo documento presenta un protocollo dettagliato che descrive la generazione, la selezione e la caratterizzazione dei cibridi.

La generazione di cybrid richiede 3 giorni di lavoro di laboratorio più un periodo di selezione (~ 2 settimane) e ulteriori 1-2 settimane per la crescita dei cloni. I passaggi critici sono la qualità dei citoplasti e il periodo di selezione. La morfologia dei cibridi assomiglia a quella delle cellule donatrici rho0. L'assegnazione del mtDNA e dell'nDNA corretti nei cibridi è obbligatoria per confermare l'identità delle cellule. Un esempio è riportato nella Figura 2. In questo...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell'origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell'attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.

Un approccio in vitro per studiare la disfunzione mitocondriale: un modello di cibridi

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

La cyber generation è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del DNA mitocondriale e per correlare la percentuale di atriplasmia con la gravità della malattia. Questa tecnica consente di eseguire indagini biochimiche in un sistema nucleare omogeneo, in cui è assente il contributo del background nucleare del paziente. Questa tecnica consente di convalidare la patogenicità di una mutazione del DNA mitocondriale.e permette di studiarne l'impatto a livello biochimico Lavare due volte le piastre da 35 millimetri contenenti i fibroblasti utilizzando due millilitri di 1X PBS senza calcio e magnesio. Pulire la superficie esterna dei piatti con etanolo al 70% e attendere che l'alcol evapori. Rimuovere i coperchi dai piatti e i tappi a vite dalle bottiglie.Posizionare ogni piatto senza coperchio capovolto sul fondo di ogni flacone di centrifuga da 250 millilitri. Aggiungere lentamente 32 millilitri di un mezzo di nucleazione a ciascuna bottiglia permettendo al mezzo di entrare nel piatto e di entrare in contatto con le cellule. Rimuovere eventuali bolle dai piatti usando una lunga pipetta di pascolo di vetro, curvando la punta in una fiamma bunsen.Chiudere ogni flacone con il tappo a vite e trasferirle nella centrifuga. Centrifugare per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 8.000 x G.Aspirare il mezzo dalle bottiglie e scartarlo. Rimuovere i piatti invertendo le bottiglie su una garza sterile precedentemente spruzzata con etanolo al 70%.Pulire la superficie esterna dei piatti e i loro coperchi con il 70% di etanolo e chiudere i piatti dopo che l'etanolo è evaporato. Prima di procedere controllare la formazione di citoplasti utilizzando un microscopio invertito per cellule vive. Cerca fibroblasti estremamente allungati a causa dell'estrusione dei loro nuclei indotta dalla citocalasina.Ad ogni piatto da 35 millimetri aggiungere 1.000, 143 celle zero riga. Ri-sospeso in due millilitri di terreno di coltura integrato con il 5% FBS. Lasciare i piatti per tre ore in un incubatore di anidride carbonica umidificata per sistemare le 143 celle zero file sui fantasmi.Dopo tre ore di incubazione, aspirare e scartare il mezzo. Lavare le cellule di aderenza due volte con due millilitri di mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM senza siero o MEM, quindi aspirare e scartare il mezzo. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di polietilenglicole alle cellule e incubare per esattamente un minuto.Aspirare ed eliminare la soluzione di polietilenglicole. Lavare le cellule tre volte con due millilitri di DMEM ad alto glucosio senza siero o con MEM. Aggiungere due millilitri di mezzo di fusione e incubare durante la notte nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Tripsinizzare le cellule nei restanti piatti di coltura Contarle e seminarle in una o più piastre di Petri Aggiungi da 50 a 100 cellule per piatto nella coltura integrata fino a quando non compaiono i cloni. Quindi lasciali crescere per diversi giorni. Usando uno stereomicroscopio, raccogli i cloni dalla capsula di Petri con cilindri di clonazione o una punta di pipetta.Cerca di evitare di raggruppare diversi cloni e trasferirli in una piastra da 96 pozzi, ciascuno contenente 200 microlitri di terreno di coltura integrato. I cibridi sono stati generati a partire da fibroblasti derivati da un paziente portatore dell'eteroplasmatico M2343A2G Una delle più comuni mutazioni del DNA mitocondriale associate a miopatia mitocondriale, acidosi lattica da encefalopatia ed episodi simili a ictus. L'analisi di un numero variabile di ripetizioni in tandem ha mostrato che il DNA informatico è identico alle cellule della riga zero confermando la sostituzione del DNA informatico del paziente con il genoma 143 B.Il polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione, o analisi di sequenziamento, può essere utilizzato per valutare la presenza della mutazione del DNA mitocondriale e la percentuale di eteroplasmia. Quando si tenta questo protocollo è importante verificare il corretto patrimonio genetico del NUCLEONE e del DNA mitocondriale, nonché la quantità di DNA mitocondriale nei cibridi ripopolati.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Ricerca

Genetica

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Video-EEG-ECG simultaneo monitoraggio per identificare la disfunzione Neurocardiac in modelli murini di epilessia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...