Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
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この研究は、マリアニ財団の資金提供を受けたミトコンドリア小児疾患研究センター(http://www.mitopedia.org)で実施されました。VTは、希少神経筋疾患のための欧州参照ネットワーク(ERN EURO-NMD)のメンバーです。

注:ヒト線維芽細胞の使用には、倫理的承認が必要な場合があります。この研究で使用された線維芽細胞は、MD患者に由来し、倫理的要件に従ってインスティテューショナルバイオバンクに保存された。細胞の使用についてインフォームドコンセントが提供された。室温(RT、22-25°C)の滅菌層流キャビネット下ですべての細胞培養手順を実行します。細胞培養および滅菌装置に適した滅菌ろ過溶?...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. 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mtDNAは、保護ヒストンの欠如および呼吸鎖に近いその位置のためにnDNAと比較して非常に高い突然変異率を有し、これは修復系16によって効率的に打ち消されない有害な酸化効果に分子をさらす。最初の病原性mtDNA変異は1988年17、18年に同定され、それ以来、多数の変異が記載されている。NGS技術は、ミトコンドリアゲノム全体をス?...

ミトコンドリア障害(MD)は、核(nDNA)またはミトコンドリア(mtDNA)DNAのいずれかの変異によるミトコンドリア機能の障害によって引き起こされる多系統症候群のグループである1。それらは最も一般的な遺伝性代謝疾患の1つであり、有病率は1:5,000である。mtDNA関連疾患は、ミトコンドリア遺伝学の規則に従う:母体遺伝、ヘテロプラスミーおよび閾値効果、および有糸分裂分離2。ヒトmtDNAは16.6 kbの二本鎖DNA円であり、複製および転写に必要な配列を有する短い制御領域、13のタンパク質コード遺伝子(呼吸鎖のすべてのサブユニット)、22のtRNA、および2つのrRNA遺伝子3を含む。
健常者では、単一のmtDNA遺伝子型(ホモプラスミー)が存在するが、病理学的状態においては複数の遺伝子型が共存(ヘテロプラスミー)する。有害な異質体変異は、OXPHOSを破壊し、任意の年齢で任意の臓器に影響を与える可能性のある疾患を引き起こすために、臨界閾値を克服しなければならない4.OXPHOSの二重遺伝学は遺伝を指示する:常染色体劣性または優性およびX連鎖性nDNA変異の場合、母体性はmtDNA変異の場合、および散発的な症例はnDNAおよびmtDNAの両方である。
ミトコンドリア医学時代の初めに、キングとアタルディ5による画期的な実験は、mtDNAが完全に枯渇した腫瘍細胞株(rho0細胞)とMD患者からのミトコンドリアからの核を含むハイブリッド細胞を作成することによって、MDの原因となる突然変異の起源を理解するための基礎を確立しました。 そして、核ゲノムまたはミトコンドリアゲノムに変異が存在するかどうかを判断することは容易ではなかった。1989年に記載されたこの方法は、その後、ミトコンドリア医学の分野で働くいくつかの研究者によって使用されました6,7,8,9;詳細なプロトコルが最近公開されました10, しかし、ビデオはまだ作られていません.NGSが突然変異がどこにあるかを正確かつ迅速に特定できるのに、なぜそのようなプロトコルが今日関連しているのでしょうか?その答えは、サイブリッド生成が、新規mtDNA変異の病原性役割を理解し、ヘテロプラスミーの割合を疾患の重症度と相関させ、患者の自生核バックグラウンドの寄与が存在しない均質核系において生化学的調査を行うための最先端のプロトコルである11、12,13。
このプロトコールは、35mmペトリ皿中で増殖したコンフルエントな患者由来の線維芽細胞から細胞プラストを得る方法を記載している。サイトカラシンBの存在下でのディッシュの遠心分離は、除核サイトプラストの単離を可能にし、次いで、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下でrho0 細胞と融合させる。得られたシブリッドは、クローンが発生するまで選択培地で培養される。代表的な結果のセクションは、mtDNAがドナー患者の線維芽細胞のそれと同一であり、nDNAが腫瘍性rho0 細胞株の核DNAと同一であることを証明するために、得られたシブリッドの分子特性評価の例を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

酸化的リン酸化(OXPHOS)を行うミトコンドリア呼吸鎖複合体の欠損は、ヒトミトコンドリア障害の生化学的マーカーである。遺伝的観点から見ると、OXPHOSは、核DNA(nDNA)とミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる遺伝子系の相補から生じるため、ユニークな例を表しています。したがって、OXPHOS欠損は、核およびミトコンドリアにコードされる遺伝子に影響を及ぼす変異に起因する可能性がある。
1989年に発表されたKingとAttardiによる画期的な研究は、mtDNA(rho0と名付けられた)を枯渇させたヒト細胞株が、いわゆる「トランスミトコンドリアサイブリッド」を得るために外因性ミトコンドリアによって再移入され得ることを示した。これらのシブリッドは、ミトコンドリア障害患者由来のミトコンドリア(MDs)とrho0 細胞由来の核を含むため、欠損がmtDNA関連かnDNA関連かを検証することができる。これらのサイブリッドはまた、突然変異の病原性を検証し、生化学的レベルでその影響を研究するための強力なツールです。この論文では、サイブリッドの生成、選択、および特性評価を記述する詳細なプロトコルを提示する。

サイブリッドを生成するには、3日間の実験室作業に加えて、選択期間(〜2週間)とクローンの成長のための追加の1〜2週間が必要です。重要なステップは、細胞プラストの質と選択期間です。サイブリッドの形態は、rho0 ドナー細胞の形態に類似している。サイブリッドにおける正しいmtDNAおよびnDNAの割り当ては、細胞の同一性を確認するために必須である。その一例を <strong class="xfig"...

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An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

トランスミトコンドリア・シブリッドは、ミトコンドリアDNA(mtDNA)枯渇細胞(rho0 細胞)と、ミトコンドリア障害に罹患した患者由来の細胞プラスト(除核細胞)とを融合させたハイブリッド細胞である。それらは、疾患の核またはミトコンドリア起源の決定、生化学的活性の評価、およびmtDNA関連変異体の病原性役割の確認を可能にする。

ミトコンドリア機能障害を研究するための インビトロ アプローチ:サイブリッドモデル

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

サイバー生成は、任意の新規ミトコンドリアDNA変異の病原性役割を理解し、アトリプラズムの割合を疾患の重症度と相関させるための最先端のプロトコルです。この技術は、患者の核背景の寄与が存在しない均質な核系において生化学的調査を行うことを可能にする。この技術は、ミトコンドリアDNAの変異の病原性を検証することを可能にする。生化学的レベルでその影響を研究することを可能にする カルシウムおよびマグネシウムを含まない2ミリリットルの1X PBSを使用して、線維芽細胞を含む35ミリメートルの皿を2回洗浄する。70%エタノールで皿の外表面をきれいにし、アルコールが蒸発するまで待ちます。蓋を皿から、スクリューキャップをボトルから取り外します。蓋のない各ディッシュを上下逆さまにして、各250ミリリットルの遠心ボトルの底に置きます。各ボトルに32ミリリットルの核生成培地をゆっくりと加え、培地が皿に入り、細胞と接触できるようにします。長いガラスの牧草地のピペットを使用して皿から泡を取り除き、先端をブンセンの炎で湾曲させます。各ボトルをスクリューキャップで閉じ、遠心分離機に移します。37°Cで20分間遠心分離し、8, 000 x G.ボトルから培地を吸引し、それを捨てる。以前に70%エタノールを噴霧した滅菌ガーゼの上のボトルを反転させて皿を取り除きます。皿の外面とその蓋を70%エタノールできれいにし、エタノールが蒸発した後に皿を閉じます。先に進む前に、生細胞について倒立顕微鏡を用いて細胞芽細胞形成の確認を行う。サイトカラシンによって誘導されるそれらの核の押し出しのために非常に細長い線維芽細胞を探してください。各35ミリメートルの皿に1,000,143行のゼロセルを追加します。5%FBSを添加した2ミリリットルの培養液に再懸濁した。皿を加湿二酸化炭素インキュベーターに3時間放置して、幽霊の143行のゼロ細胞を沈降させます。3時間のインキュベーションの後、培地を吸引して廃棄する。付着細胞を血清またはMEMを含まない2ミリリットルのDMEM高グルコース培地で2回洗浄し、次いで培地を吸引して廃棄する。500マイクロリットルのポリエチレングリコール溶液を細胞に加え、正確に1分間インキュベートする。ポリエチレングリコール溶液を吸引し、廃棄する。血清なしまたはMEMで2ミリリットルのDMEM高グルコースで細胞を3回洗浄する。2ミリリットルの融合培地を加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーター内で一晩インキュベートする。残りの培養皿中の細胞をトリプシン処理する それらを数えて1つ以上のペトリ皿に播種する クローンが現れるまで補充培養物に皿あたり50〜100個の細胞を加える。それから数日間成長させてください。実体顕微鏡を使用して、クローニングシリンダーまたはピペットチップを備えたペトリ皿からクローンをピックアップします。異なるクローンをプールすることを避け、各ウェルに200マイクロリットルの補充培養培地を含む96ウェルプレートに移すようにしてください。サイブリッドは、ミトコンドリアミオパチー、脳症乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに関連する最も一般的なミトコンドリアDNA変異の1つであるヘテロプラズムM2343A2Gを保有する患者由来の線維芽細胞から生成した。可変数のタンデムリピートの分析は、サイバーDNAが、患者のサイバーDNAを143Bゲノムで置換することを確認する行ゼロ細胞と同一であることを示した。制限断片長多型、またはシーケンシング分析は、ミトコンドリアDNA変異の存在およびヘテロプラスミーパーセンテージを評価するために使用することができる。このプロトコルを試みるときは、核子およびミトコンドリアDNAの正しい遺伝的資産、ならびに再移入されたサイブリッド中のミトコンドリアDNA量を検証することが重要である。

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

てんかんのマウス ・ モデルにおける Neurocardiac 機能障害を識別するために監視同時ビデオ脳波心電図

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

ミトコンドリア機能障害を研究するための インビトロ アプローチ:サイブリッドモデル

ミトコンドリア機能障害を研究するためのインビトロアプローチ:サイブリッドモデル