Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
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Este estudo foi realizado no Centro de Estudos de Doenças Pediátricas Mitocondriais (http://www.mitopedia.org), financiado pela Fundação Mariani. VT é membro da European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

NOTA: O uso de fibroblastos humanos pode exigir aprovação ética. Os fibroblastos utilizados neste estudo foram derivados de pacientes com MD e armazenados no biobanco institucional em conformidade com as exigências éticas. Foi previsto consentimento informado para o uso das células. Realize todos os procedimentos de cultura celular sob um gabinete de fluxo laminar estéril à temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Use soluções filtradas estéreis adequadas para a cultura celular e equipamentos estéreis. Cresça t...

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	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

O mtDNA tem uma taxa de mutação muito alta em comparação com o NDNA devido à falta de histonas protetoras e sua localização perto da cadeia respiratória, o que expõe a molécula a efeitos oxidativos prejudiciais não neutralizados eficientemente pelos sistemas de reparo16. As primeiras mutações patogênicas de MTDNA foram identificadas em 198817,18 e, desde então, um grande número de mutações foram descritas. A tecnologia NG...

Os distúrbios mitocondriais (DM) são um grupo de síndromes multissistemas causadas por um comprometimento nas funções mitocondriais devido a mutaçõesno DNA nuclear (nDNA) ou mitocondrial (mtDNA). Estão entre as doenças metabólicas herdadas mais comuns, com prevalência de 1:5.000. as doenças associadas ao MTDNA seguem as regras da genética mitocondrial: herança materna, heteroplasma e efeito limiar, e segregação mitótica2. O mtDNA humano é um círculo de DNA de dupla rega de 16,6 kb, que contém uma região de controle curto com sequências necessárias para replicação e transcrição, 13 genes codificadores de proteínas (todas subunidades da cadeia respiratória), 22 tRNA e 2 genes rRNA3.
Em indivíduos saudáveis, há um único genótipo de MTDNA (homoplasma), enquanto mais de um genótipo coexiste (heteroplasma) em condições patológicas. Mutações heteroplasmáticas deletérias devem superar um limiar crítico para interromper o OXPHOS e causar doenças que podem afetar qualquer órgão a qualquer idade aos4 anos. A genética dupla do OXPHOS dita a herança: recessiva autossômica ou dominante e ligada a X para mutações de nDNA, materna para mutações de MTDNA, além de casos esporádicos tanto para nDNA quanto para dNA.
No início da era da medicina mitocondrial, um experimento marcante de King e Attardi5 estabeleceu a base para entender a origem de uma mutação responsável por um DM, criando células híbridas contendo núcleos de linhas de células tumorais nas quais o MTDNA estava totalmente esgotado (rho0 células) e mitocôndrias de pacientes com DM. Técnicas de sequenciamento de última geração (GNS) não estavam disponíveis naquela época, e não foi fácil determinar se uma mutação estava presente no genoma nuclear ou mitocondrial. O método, descrito em 1989, foi então utilizado por vários pesquisadores que atuam no campo da medicina mitocondrial 6,7,8,9; um protocolo detalhado foi publicado recentemente10, mas nenhum vídeo foi feito ainda. Por que tal protocolo deveria ser relevante hoje em dia quando o NGS poderia identificar com precisão e rapidez onde uma mutação está localizada? A resposta é que a geração cibrid ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação mtDNA, correlacionar a porcentagem de heteroplasma com a gravidade da doença, e realizar uma investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo no qual a contribuição do fundo nuclear autóctono do paciente está ausente11, 12,13.
Este protocolo descreve como obter citoplastos de fibroblastos confluentes e derivados do paciente cultivados em placas de Petri de 35 mm. A centrifugação dos pratos na presença de citochalasina B permite o isolamento de citoplastos enucleados, que são então fundidos com células rho0 na presença de polietileno glicol (PEG). Os cibrids resultantes são então cultivados em meio seletivo até que os clones surjam. A seção de resultados representativos mostra um exemplo de caracterização molecular dos cibridos resultantes para provar que o mtDNA é idêntico ao dos fibroblastos dos pacientes doadores e que o nDNA é idêntico ao DNA nuclear da linha celular rho0 tumoral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Deficiência dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial que realizam fosforilação oxidativa (OXPHOS) é o marcador bioquímico das doenças mitocondriais humanas. Do ponto de vista genético, o OXPHOS representa um exemplo único porque resulta da complementação de dois sistemas genéticos distintos: DNA nuclear (nDNA) e DNA mitocondrial (mtDNA). Portanto, os defeitos oxphos podem ser devido a mutações que afetam genes codificados nucleares e mitocondriais.
O trabalho inovador de King e Attardi, publicado em 1989, mostrou que as linhas celulares humanas esgotadas de mtDNA (chamada rho0) poderiam ser repovoadas por mitocôndrias exógenas para obter os chamados "cibrids transmissores". Graças a esses cibrids contendo mitocôndrias derivadas de pacientes com distúrbios mitocondriais (DM) e núcleos de células rho0 , é possível verificar se um defeito está relacionado com MTDNA ou nDNA. Esses cibrids também são uma ferramenta poderosa para validar a patogenicidade de uma mutação e estudar seu impacto a um nível bioquímico. Este artigo apresenta um protocolo detalhado descrevendo geração, seleção e caracterização cibrid.

A geração de cibrids requer 3 dias de trabalho laboratorial mais um período de seleção (~2 semanas) e 1-2 semanas adicionais para o crescimento de clones. As etapas críticas são a qualidade dos citoplastos e o período de seleção. A morfologia dos cibrids se assemelha à das células doadoras rho0. A atribuição do mtDNA correto e nDNA nos cibrids é obrigatória para confirmar a identidade das células. Um exemplo é dado na Figura 2. Neste caso, geramos cibrids a parti...

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An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Cibridos transmissocondriais são células híbridas obtidas pela fusão de DNA mitocondrial (mtDNA) células esgotadas (células rho0 ) com citoplastas (células enucleadas) derivadas de pacientes afetados por distúrbios mitocondriais. Permitem a determinação da origem nuclear ou mitocondrial da doença, avaliação da atividade bioquímica e confirmação do papel patogênico das variantes relacionadas ao MTDNA.

Uma abordagem in vitro para estudar disfunção mitocondrial: um modelo cibrid

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

A geração cibernética ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação de DNA mitocondrial e correlacionar a porcentagem de atriplasmia com a gravidade da doença. Esta técnica permite a realização de investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo, no qual a contribuição do fundo nuclear do paciente está ausente. Esta técnica permite validar a patogenicidade de uma mutação do DNA mitocondrial.e torna possível estudar seu impacto a nível bioquímico Lavar os pratos de 35 milímetros contendo os fibroblastos duas vezes usando dois mililitros de 1X PBS sem cálcio e magnésio. Limpe a superfície externa dos pratos com 70% de etanol, e espere até que o álcool evapore. Retire as tampas dos pratos e as tampas dos parafusos das garrafas.Coloque cada prato sem a tampa de cabeça para baixo na parte inferior de cada garrafa centrífuga de 250 mililitros. Adicione lentamente 32 mililitros de um meio de nucleação a cada garrafa permitindo que o meio entre no prato e entre em contato com as células. Remova todas as bolhas dos pratos usando uma pipeta de pastagem de vidro longa, curvando a ponta em uma chama bunsen.Feche cada garrafa com a tampa do parafuso e transfira-as para a centrífuga. Centrifugar por 20 minutos a 37 graus Celsius e 8.000 x G.Aspire o meio das garrafas e descarte-o. Retire os pratos invertendo as garrafas em uma gaze estéril previamente pulverizada com 70% de etanol.Limpe a superfície externa dos pratos e suas tampas com 70% de etanol, e feche os pratos depois que o etanol evaporar. Antes de prosseguir, verifique se há formação de citoplastia usando um microscópio invertido para células vivas. Procure por fibroblastos extremamente alongados devido à extrusão de seus núcleos induzidos por citochalasina.A cada prato de 35 milímetros adicione 1.000, 143 células de linha zero. Re suspendido em dois mililitros de cultura médio suplementado com 5%FBS. Deixe os pratos por três horas em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado para resolver as 143 células da linha zero nos fantasmas.Após três horas de incubação, aspire e descarte o meio. Lave as células de adesão duas vezes com dois mililitros de DMEM de alto meio de glicose sem soro ou MEM, depois aspire e descarte o meio. Adicione 500 microliters de solução de polietileno glicol às células e incubar por exatamente um minuto.Aspire e descarte a solução de polietileno glicol. Lave as células três vezes com dois mililitros de DMEM de alta glicose sem soro ou com MEM. Adicione dois mililitros de meio de fusão, e incubar durante a noite na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Trypsinize as células nos pratos de cultura restantes Conte-as e semee-as em uma ou mais placas de Petri Adicione 50 a 100 células por prato na cultura suplementada até que os clones apareçam. Então deixe-os crescer por vários dias. Usando um microscópio estéreo, pegue os clones da placa de Petri com cilindros de clonagem ou uma ponta de pipeta.Tente evitar a junção de diferentes clones e transfira-os para uma placa de 96 poços, cada um contendo 200 microliters de meio de cultura suplementar. Cibrids foram gerados a partir de fibroblastos derivados de um paciente portador do M2343A2G heteroplasmático Uma das mutações de DNA mitocondrial mais comuns associadas à miopatia mitocondrial, acidose lacótica encefalopatia e episódios semelhantes a derrame. A análise de um número variável de repetições tandem mostrou que o DNA cibernético é idêntico às células da linha zero confirmando a substituição do DNA cibernético do paciente pelo genoma de 143 B.O polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição, ou análises de sequenciamento, pode ser usado para avaliar a presença da mutação do DNA mitocondrial e a porcentagem de heteroplasma. Ao tentar este protocolo é importante verificar o ativo genético correto do DNA nucleon e mitocondrial, bem como a quantidade de DNA mitocondrial nos cibridos repovoados.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genética

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Simultânea vídeo-EEG-ECG de monitoramento para identificar a disfunção Neurocardiac em modelos de Mouse de epilepsia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...