Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Это исследование было проведено в Центре изучения митохондриальных педиатрических заболеваний (http://www.mitopedia.org), финансируемом Фондом Мариани. VT является членом Европейской референс-сети по редким нервно-мышечным заболеваниям (ERN EURO-NMD).

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование фибробластов человека может потребовать этического одобрения. Фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от пациентов с МД и хранились в институциональном биобанке в соответствии с этическими требованиями. На использование камер было дано...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

МтДНК имеет очень высокую частоту мутаций по сравнению с нДНК из-за отсутствия защитных гистонов и ее расположения близко к дыхательной цепи, что подвергает молекулу повреждающим окислительным эффектам, не эффективно противодействуемым системами репарации16. Первые пато?...

Митохондриальные расстройства (МД) представляют собой группу мультисистемных синдромов, вызванных нарушением митохондриальных функций из-за мутаций в ядерной (нДНК) или митохондриальной (мтДНК) ДНК1. Они являются одними из наиболее распространенных наследственных метаболических заболеваний, с распространенностью 1: 5000. мтДНК-ассоциированные заболевания следуют правилам митохондриальной генетики: материнское наследование, гетероплазма и пороговый эффект, митотическая сегрегация2. МтДНК человека представляет собой двухцепочечный круг ДНК размером 16,6 кб, который содержит короткую контрольную область с последовательностями, необходимыми для репликации и транскрипции, 13 генов, кодирующих белок (все субъединицы дыхательной цепи), 22 тРНК и 2 гена рРНК3.
У здоровых людей существует один единственный генотип мтДНК (гомоплазма), тогда как в патологических состояниях сосуществует более одного генотипа (гетероплазмы). Вредные гетероплазматические мутации должны преодолеть критический порог, чтобы нарушить OXPHOS и вызвать заболевания, которые могут поразить любой орган в любом возрасте4 лет. Двойная генетика OXPHOS диктует наследование: аутосомно-рецессивная или доминантная и X-сцепленная для мутаций нДНК, материнская для мутаций мтДНК, плюс спорадические случаи как для нДНК, так и для мтДНК.
В начале эры митохондриальной медицины знаковый эксперимент Кинга и Аттарди5 установил основу для понимания происхождения мутации, ответственной за MD, путем создания гибридных клеток, содержащих ядра из опухолевых клеточных линий, в которых мтДНК была полностью истощена (rho0 клеток) и митохондрий у пациентов с MD. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) в то время были недоступны. и было нелегко определить, присутствует ли мутация в ядерном или митохондриальном геноме. Метод, описанный в 1989 году, затем использовался несколькими исследователями, работающими в области митохондриальной медицины 6,7,8,9; подробный протокол был недавно опубликован10, но видео еще не было сделано. Почему такой протокол должен быть актуален в настоящее время, когда NGS может точно и быстро определить, где находится мутация? Ответ заключается в том, что генерация цибрид по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации мтДНК, корреляции процента гетероплазмы с тяжестью заболевания и выполнения биохимического исследования в однородной ядерной системе, в которой вклад автохтонного ядерного фона пациента отсутствует11, 12,13.
Этот протокол описывает, как получить цитопласты из сливающихся фибробластов, полученных от пациента, выращенных в 35 мм чашках Петри. Центрифугирование посуды в присутствии цитохалазина В позволяет выделить энуклеированные цитопласты, которые затем сплавляются с rho0 клетками в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полученные цибриды затем культивируются в селективной среде до тех пор, пока не появятся клоны. В разделе репрезентативных результатов приведен пример молекулярной характеристики полученных цибрид, чтобы доказать, что мтДНК идентична фибробластам пациентов-доноров и что нДНК идентична ядерной ДНК опухолевой клеточной линии rho0 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Дефицит комплексов митохондриальной дыхательной цепи, осуществляющих окислительное фосфорилирование (OXPHOS), является биохимическим маркером митохондриальных нарушений человека. С генетической точки зрения OXPHOS представляет собой уникальный пример, потому что он является результатом дополнения двух различных генетических систем: ядерной ДНК (нДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК). Таким образом, дефекты OXPHOS могут быть вызваны мутациями, влияющими на ядерные и митохондриальные кодированные гены.
Новаторская работа Кинга и Аттарди, опубликованная в 1989 году, показала, что клеточные линии человека, истощенные мтДНК (названные rho0), могут быть повторно заселены экзогенными митохондриями для получения так называемых «транспамохондриальных цибрид». Благодаря этим цибридам, содержащим митохондрии, полученные от пациентов с митохондриальными расстройствами (МД) и ядрами из клеток rho0 , можно проверить, связан ли дефект с мтДНК или нДНК. Эти цибриды также являются мощным инструментом для проверки патогенности мутации и изучения ее влияния на биохимическом уровне. В этой статье представлен подробный протокол, описывающий генерацию, отбор и характеристику цибрид.

Генерация цибрид требует 3 дней лабораторных работ плюс период отбора (~2 недели) и дополнительные 1-2 недели для роста клонов. Важнейшими этапами являются качество цитопластов и период отбора. Морфология цибрид напоминает морфологию донорских клеток rho0. Назначение правильной мтДН...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho0 клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.

Подход in vitro к изучению митохондриальной дисфункции: модель Cybrid

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Кибергенерация по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации митохондриальной ДНК и корреляции процента атриплазмы с тяжестью заболевания. Данная методика позволяет проводить биохимическое исследование в однородной ядерной системе, в которой отсутствует вклад ядерного фона пациента. Этот метод позволяет проверить патогенность мутации митохондриальной ДНК.и дает возможность изучить его влияние на биохимическом уровне Мыть 35-миллиметровую посуду, содержащую фибробласты, дважды, используя два миллилитра 1X PBS без кальция и магния. Очистите внешнюю поверхность посуды 70% этанолом, и подождите, пока спирт испарится. Снимите крышки с посуды и завинчивающиеся крышки с бутылок.Поместите каждое блюдо без крышки вверх ногами на дно каждой бутылки центрифуги объемом 250 миллилитров. Медленно добавляйте 32 миллилитра нуклеационной среды в каждую бутылку, позволяя среде войти в чашку и войти в контакт с клетками. Удалите все пузырьки с посуды с помощью длинной стеклянной пастбищной пипетки, искривив кончик в пламени Бунзена.Закройте каждую бутылку винтовой крышкой и перенесите их в центрифугу. Центрифуга в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 8 000 х Г.Аспирируйте среду из бутылок и выбрасывайте ее. Снимите посуду, перевернув флаконы на стерильной марле, предварительно опрысканной 70% этанолом.Очистите внешнюю поверхность посуды и ее крышек 70% этанолом и закройте посуду после того, как этанол испарится. Перед началом проверьте образование цитопласта с помощью инвертированного микроскопа для живых клеток. Ищите чрезвычайно вытянутые фибробласты из-за экструзии их ядер, индуцированных цитохалазином.К каждой 35-миллиметровой тарелке добавьте 1 000, 143 рядных нулевых ячеек. Повторно суспендируется в двух миллилитрах питательной среды, дополненной 5% FBS. Оставьте посуду на три часа в увлажненном инкубаторе углекислого газа, чтобы поселить 143 рядные нулевые клетки на призраках.После трех часов инкубации аспирировать и выбросить среду. Дважды промыть клетки адгезии двумя миллилитрами среды DMEM с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или MEM, затем аспирировать и выбросить среду. Добавьте в клетки 500 микролитров раствора полиэтиленгликоля и инкубируйте ровно одну минуту.Аспирировать и выбросить раствор полиэтиленгликоля. Промыть клетки три раза двумя миллилитрами ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или с ПОМОЩЬЮ МЭМ. Добавьте два миллилитра термоядерной среды и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.Попробуйте клетки в оставшихся чашках культуры Подсчитайте их и посейте в одну или несколько чашек Петри Добавьте от 50 до 100 клеток на чашку в дополненной культуре, пока не появятся клоны. Затем дайте им расти в течение нескольких дней. С помощью стереомикроскопа подберите клонов из чашки Петри с помощью клонирующих цилиндров или наконечника пипетки.Старайтесь избегать объединения различных клонов и переносите их на плиту из 96 скважин, каждая из которых содержит 200 микролитров дополненной питательной среды. Цибриды были получены, начиная с фибробластов, полученных от пациента, несущего гетероплазматический M2343A2G Одна из наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК, связанных с митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами. Анализ переменного числа тандемных повторов показал, что кибер-ДНК идентична нулевым клеткам ряда, что подтверждает замену кибер-ДНК пациента геномом 143 B.Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента, или анализ секвенирования, может быть использован для оценки наличия мутации митохондриальной ДНК и процента гетероплазмы. При попытке этого протокола важно проверить правильный генетический актив нуклонной и митохондриальной ДНК, а также количество митохондриальной ДНК в повторно заселенных цибридах.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Одновременная видео ЭЭГ-мониторинг ЭКГ для выявления Neurocardiac дисфункции в моделях мыши эпилепсии

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

В vitro биохимические анализы с использованием биотина этикетки для изучения белково-нуклеиновой кислоты взаимодействия

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...