Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Denna studie genomfördes i Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), finansierad av Mariani Foundation. VT är medlem i det europeiska referensnätverket för sällsynta neuromuskulära sjukdomar (ERN EURO-NMD).

OBS: Användningen av humana fibroblaster kan kräva etiskt godkännande. Fibroblaster som användes i denna studie härleddes från MD-patienter och lagrades i den institutionella biobanken i enlighet med etiska krav. Informerat samtycke lämnades för användning av cellerna. Utför alla cellodlingsprocedurer under ett sterilt laminärt flödesskåp vid rumstemperatur (RT, 22-25 ° C). Använd sterilfiltrerade lösningar som är lämpliga för cellodling och steril utrustning. Odla alla cellinjer i en fuktad inkubator ...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

MtDNA har en mycket hög mutationshastighet jämfört med nDNA på grund av bristen på skyddande histoner och dess placering nära andningskedjan, vilket utsätter molekylen för skadliga oxidativa effekter som inte effektivt motverkas av reparationssystemen16. De första patogena mtDNA-mutationerna identifierades 198817,18, och sedan dess har ett stort antal mutationer beskrivits. NGS-teknik är ett relevant tillvägagångssätt för att...

Mitokondriella störningar (MD) är en grupp multisystemsyndrom som orsakas av en försämring av mitokondriella funktioner på grund av mutationer i antingen nukleärt (nDNA) eller mitokondriellt (mtDNA) DNA1. De är bland de vanligaste ärftliga metaboliska sjukdomarna, med en prevalens på 1: 5000. mtDNA-associerade sjukdomar följer reglerna för mitokondriell genetik: moderns arv, heteroplasma och tröskeleffekt och mitotisk segregering2. Humant mtDNA är en dubbelsträngad DNA-cirkel på 16,6 kb, som innehåller en kort kontrollregion med sekvenser som behövs för replikation och transkription, 13 proteinkodande gener (alla subenheter i andningskedjan), 22 tRNA och 2 rRNA-gener3.
Hos friska individer finns det en enda mtDNA-genotyp (homoplasi), medan mer än en genotyp samexisterar (heteroplasmi) vid patologiska tillstånd. Skadliga heteroplasmatiska mutationer måste övervinna en kritisk tröskel för att störa OXPHOS och orsaka sjukdomar som kan påverka alla organ vid alla åldrar4. Oxphos dubbla genetik dikterar arv: autosomalt recessivt eller dominerande och X-länkat för nDNA-mutationer, moder för mtDNA-mutationer, plus sporadiska fall både för nDNA och mtDNA.
I början av mitokondriell medicin era, ett landmärke experiment av King och Attardi5 etablerade grunden för att förstå ursprunget till en mutation som är ansvarig för en MD genom att skapa hybridceller som innehåller kärnor från tumörcellinjer där mtDNA var helt utarmat (rho0-celler) och mitokondrier från patienter med MD. Nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) var inte tillgängliga vid den tiden, och det var inte lätt att avgöra om en mutation var närvarande i kärn- eller mitokondriellt genom. Metoden, som beskrevs 1989, användes sedan av flera forskare som arbetar inom mitokondriell medicin 6,7,8,9; ett detaljerat protokoll har nyligen publicerats10, men ingen video har gjorts ännu. Varför skulle ett sådant protokoll vara relevant idag när NGS exakt och snabbt kunde identifiera var en mutation finns? Svaret är att cybridgenerering fortfarande är det senaste protokollet för att förstå den patogena rollen hos någon ny mtDNA-mutation, korrelera andelen heteroplasmi med svårighetsgraden av sjukdomen och utföra en biokemisk undersökning i ett homogent kärnsystem där bidraget från patientens autoktona kärnbakgrund är frånvarande11, 12,13.
Detta protokoll beskriver hur man erhåller cytoplaster från sammanflytande, patienthärledda fibroblaster odlade i 35 mm petriskålar. Centrifugering av diskarna i närvaro av cytokalasin B möjliggör isolering av enukleerade cytoplaster, vilka sedan smälts med rho0-celler i närvaro av polyetylenglykol (PEG). De resulterande cybriderna odlas sedan i selektivt medium tills kloner uppstår. Det representativa resultatavsnittet visar ett exempel på molekylär karakterisering av de resulterande cybriderna för att bevisa att mtDNA är identiskt med det hos givarpatienternas fibroblaster och att nDNA är identiskt med kärn-DNA i tumöral rho 0-cellinjen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Brist på mitokondriella andningskedjekomplex som utför oxidativ fosforylering (OXPHOS) är den biokemiska markören för humana mitokondriella störningar. Ur genetisk synvinkel representerar OXPHOS ett unikt exempel eftersom det härrör från komplementeringen av två distinkta genetiska system: kärn-DNA (nDNA) och mitokondriellt DNA (mtDNA). Därför kan OXPHOS-defekter bero på mutationer som påverkar kärn- och mitokondriella kodade gener.
Det banbrytande arbetet av King och Attardi, som publicerades 1989, visade att mänskliga cellinjer utarmade av mtDNA (kallad rho0) kunde återbefolkas av exogena mitokondrier för att erhålla de så kallade "transmitochondriala cybriderna". Tack vare dessa cybrider som innehåller mitokondrier härrörande från patienter med mitokondriella störningar (MD) och kärnor från rho0-celler är det möjligt att verifiera om en defekt är mtDNA- eller nDNA-relaterad. Dessa cybrider är också ett kraftfullt verktyg för att validera patogeniciteten hos en mutation och studera dess inverkan på biokemisk nivå. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll som beskriver cybridgenerering, urval och karakterisering.

Att generera cybrider kräver 3 dagars laboratoriearbete plus en urvalsperiod (~ 2 veckor) och ytterligare 1-2 veckor för tillväxt av kloner. De kritiska stegen är kvaliteten på cytoplaster och urvalsperioden. Cybridernas morfologi liknar den hos rho 0-givarcellerna. Tilldelning av rätt mtDNA och nDNA i cybriderna är obligatorisk för att bekräfta cellernas identitet. Ett exempel ges i figur 2. I detta fall genererade vi cybrider med utgångspunkt från fibroblaster härrö...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitochondriala cybrider är hybridceller erhållna genom att smälta mitokondriellt DNA (mtDNA) -utarmade celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerade celler) härrörande från patienter som drabbats av mitokondriella störningar. De möjliggör bestämning av sjukdomens nukleära eller mitokondriella ursprung, utvärdering av biokemisk aktivitet och bekräftelse av den patogenetiska rollen hos mtDNA-relaterade varianter.

En in vitro-metod för att studera mitokondriell dysfunktion: En cybridmodell

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Cybergenerering är fortfarande det senaste protokollet för att förstå den patogena rollen hos någon ny mitokondriell DNA-mutation och för att korrelera andelen atriplasmi med svårighetsgraden av sjukdomen. Denna teknik möjliggör utförande av biokemisk undersökning i ett homogent kärnsystem, där bidraget från patientens kärnbakgrund är frånvarande. Denna teknik möjliggör validering av patogeniciteten hos en mutation av mitokondriellt DNA.och gör det möjligt att studera dess inverkan på biokemisk nivå Tvätta 35 millimeter diskarna som innehåller fibroblasterna två gånger med två milliliter 1X PBS utan kalcium och magnesium. Rengör diskens yttre yta med 70% etanol och vänta tills alkoholen avdunstar. Ta bort locken från diskarna och skruvlocken från flaskorna.Placera varje skål utan locket upp och ner i botten av varje centrifugflaska på 250 ml. Tillsätt långsamt 32 ml kärnmedium till varje flaska så att mediet kan komma in i skålen och komma i kontakt med cellerna. Ta bort eventuella bubblor från diskarna med en lång glaspipett och böj spetsen i en bunsenflamma.Stäng varje flaska med skruvlocket och överför dem till centrifugen. Centrifugera i 20 minuter vid 37 grader Celsius och 8 000 x G.Aspirera mediet från flaskorna och kassera det. Ta bort diskarna genom att invertera flaskorna på en steril gasbindning som tidigare sprutats med 70%etanol.Rengör diskens yttre yta och locken med 70% etanol och stäng diskarna efter att etanolen avdunstar. Innan du fortsätter kontrollera om cytoplastbildning använder ett inverterat mikroskop för levande celler. Leta efter extremt långsträckta fibroblaster på grund av extrudering av deras kärnor inducerade av cytokalasin.Till varje 35 millimeter skål lägg till 1000, 143 rad noll celler. Återupphängd i två milliliter odlingsmedium kompletterat med 5% FBS. Lämna diskarna i tre timmar i en fuktad koldioxidinkubator för att lösa de 143 rad nollcellerna på spökena.Efter tre timmars inkubation, aspirera och kassera mediet. Tvätta vidhäftningscellerna två gånger med två milliliter DMEM-högglukosmedium utan serum eller MEM, aspirera sedan och kassera mediet. Tillsätt 500 mikroliter polyetylenglykollösning till cellerna och inkubera i exakt en minut.Aspirera och kassera polyetylenglykollösningen. Tvätta cellerna tre gånger med två milliliter DMEM hög glukos utan serum eller med MEM. Tillsätt två milliliter fusionsmedium och inkubera över natten i inkubatorn vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Trypsinisera cellerna i de återstående odlingsrätterna Räkna dem och frö dem i en eller flera petriskålar Lägg till 50 till 100 celler per maträtt i den kompletterade kulturen tills kloner dyker upp. Låt dem sedan växa i flera dagar. Använd ett stereomikroskop och plocka upp klonerna från petriskålen med kloningscylindrar eller en pipettspets.Försök att undvika att slå samman olika kloner och överför dem till en 96 brunnsplatta, var och en väl innehållande 200 mikroliter kompletterat odlingsmedium. Cybrider genererades med utgångspunkt från fibroblaster härrörande från en patient som bär den heteroplasmatiska M2343A2G En av de vanligaste mitokondriella DNA-mutationerna associerade med mitokondriell myopati, encefalopati mjölksyraacidos och strokeliknande episoder. Analys av ett varierande antal tandemupprepningar visade att cyber-DNA är identiskt med rad nollcellerna som bekräftar ersättningen av patientens cyber-DNA med 143 B-genomet.Restriktionsfragmentlängdspolymorfism, eller sekvenseringsanalyser, kan användas för att bedöma förekomsten av mitokondriell DNA-mutation och heteroplasminprocenten. När man försöker detta protokoll är det viktigt att verifiera den korrekta genetiska tillgången hos nukleonen och mitokondriellt DNA, liksom den mitokondriella DNA-mängden i de repopulerade cybriderna.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematoder Caenorhabditis Elegans - en mångsidig In Vivo -modell för att studera värd-mikrobinteraktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidiga Video-EEG-EKG-övervakning för att identifiera Neurocardiac dysfunktion i musmodeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta Caenorhabditis elegans livslängd

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

En fluorescens-baserad metod för att studera bakteriell genreglering i infekterade vävnader

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Användningen av mus mammary tumörceller i en in vitro-invasion analys som ett mått på onkogena cell beteende

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...