Name: an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

Bu çalışma, Mariani Vakfı tarafından finanse edilen Mitokondriyal Çocuk Hastalıkları Çalışmaları Merkezi'nde (http://www.mitopedia.org) gerçekleştirilmiştir. VT, Nadir Nöromüsküler Hastalıklar için Avrupa Referans Ağı'nın (ERN EURO-NMD) bir üyesidir.

NOT: İnsan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan fibroblastlar MD hastalarından türetilmiş ve etik gerekliliklere uygun olarak Kurumsal biyobankada saklanmıştır. Hücrelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verildi. Tüm hücre kültürü prosedürlerini steril laminer akış kabini altında oda sıcaklığında (RT, 22-25 °C) gerçekleştirin. Hücre kültürü ve steril ekipmanlar için uygun steril filtrelenmiş çözeltiler kullanın. Nemlendirilmiş bir...

<ol>
	<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li><li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+and+disease.">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li><li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+maintenance+defects.">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+lacking+mtDNA:+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation.">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li><li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--&gt;G+(ATP6)+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP/O+ratio.">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T--&gt;G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li><li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia.">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li><li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G:C+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids.">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li><li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants.">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).</li><li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+-+Cybrid+technology.">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li><li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6/8+mutations+in+adult+patients.">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS.">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).</li><li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Mitochondrial+DNA:+Particularities+and+diseases.">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).</li><li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA.">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li><li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction:+application+to+the+apolipoprotein+B+3'+hypervariable+region.">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li><li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations.">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).</li><li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber's+hereditary+optic+neuropathy.">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li><li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies.">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li><li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells.">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li><li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases.">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).</li><li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs.">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li><li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cybrids,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li><li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease.">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li><li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease:+focus+on+mitochondrial+DNA.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).</li><li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization.">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li><li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington's+disease+human+cybrids.">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li><li>Cruz-Berm&#250;dez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer.">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical &amp; Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li><li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin,+an+anticancer+drug:+implications+for+drug+resistance+and+side+effects.">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).</li></ol>

mtDNA, koruyucu histonların eksikliği ve solunum zincirine yakın konumu nedeniyle nDNA'ya kıyasla çok yüksek bir mutasyon oranına sahiptir, bu da molekülü onarım sistemleri tarafından verimli bir şekilde karşı konulamayan zararlı oksidatif etkilere maruz bırakır16. İlk patojenik mtDNA mutasyonları 1988'de17,18 olarak tanımlandı ve o zamandan beri çok sayıda mutasyon tanımlandı. NGS teknolojisi, tüm mitokondriyal g...

Mitokondriyal bozukluklar (MD'ler), nükleer (nDNA) veya mitokondriyal (mtDNA) DNA1'deki mutasyonlara bağlı mitokondriyal fonksiyonlardaki bozulmanın neden olduğu bir grup multisistem sendromudur. En sık görülen kalıtsal metabolik hastalıklar arasındadır ve prevalansı 1:5.000'dir. mtDNA ile ilişkili hastalıklar mitokondriyal genetik kurallarını izler: maternal kalıtım, heteroplazmi ve eşik etkisi ve mitotik ayrışma2. İnsan mtDNA'sı, replikasyon ve transkripsiyon için gerekli diziler, 13 protein kodlayan gen (solunum zincirinin tüm alt birimleri), 22 tRNA ve 2 rRNAgeni 3 içeren kısa bir kontrol bölgesi içeren 16.6 kb'lik çift sarmallı bir DNA çemberidir.
Sağlıklı bireylerde, patolojik koşullarda tek bir mtDNA genotipi (homoplazmi) bulunurken, birden fazla genotip (heteroplazmi) bir arada bulunur. Zararlı heteroplazmik mutasyonlar, OXPHOS'u bozmak ve4 yaşında herhangi bir organı etkileyebilecek hastalıklara neden olmak için kritik bir eşiğin üstesinden gelmelidir. OXPHOS'un ikili genetiği kalıtımı belirler: nDNA mutasyonları için otozomal resesif veya baskın ve X'e bağlı, mtDNA mutasyonları için anne, artı hem nDNA hem de mtDNA için sporadik vakalar.
Mitokondriyal tıp çağının başlangıcında, King ve Attardi5 tarafından yapılan bir dönüm noktası deneyi, mtDNA'nın tamamen tükendiği tümör hücre hatlarından (rho0 hücreleri) çekirdek içeren hibrit hücreler ve MD'li hastalardan mitokondri içeren hibrit hücreler yaratarak bir MD'den sorumlu bir mutasyonun kökenini anlamak için temel oluşturdu. ve nükleer veya mitokondriyal genomda bir mutasyonun mevcut olup olmadığını belirlemek kolay değildi. 1989'da tanımlanan yöntem daha sonra mitokondriyal tıp alanında çalışan birkaç araştırmacı tarafından kullanıldı 6,7,8,9; 10 yakın zamanda ayrıntılı bir protokol yayınlandı, ancak henüz bir video yapılmadı. NGS'nin bir mutasyonun nerede olduğunu kesin ve hızlı bir şekilde tanımlayabildiği günümüzde böyle bir protokol neden geçerli olmalıdır? Cevap, cybrid üretiminin, herhangi bir yeni mtDNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak, heteroplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek ve hastanın otokton nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal bir araştırma yapmak için hala en gelişmiş protokol olmasıdır11, 12,13.
Bu protokol, 35 mm Petri kaplarında yetiştirilen birleşik, hasta kaynaklı fibroblastlardan sitoplastların nasıl elde edileceğini açıklar. Çanakların sitoçalasin B varlığında santrifüjlenmesi, daha sonra polietilen glikol (PEG) varlığında rho0 hücreleri ile kaynaştırılan enüklee sitoplastların izolasyonuna izin verir. Elde edilen sibridler daha sonra klonlar ortaya çıkana kadar seçici ortamda yetiştirilir. Temsili sonuçlar bölümü, mtDNA'nın donör hastaların fibroblastlarınınkiyle aynı olduğunu ve nDNA'nın tümöral rho0 hücre hattının nükleer DNA'sı ile aynı olduğunu kanıtlamak için ortaya çıkan sibridlerin moleküler karakterizasyonunun bir örneğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Cell Culture DNA extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25</td>
			<td>7,200 rcf, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles, 250 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B from Drechslera dematioidea</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2743-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26400-036 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute Anhydrous</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>414601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FetalClone III (Bovine Serum Product)</td>
			<td>Cytiva - HyClone Laboratories</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M4150NO250SP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory autoclave Vapormatic 770</td>
			<td>Labotech</td>
			<td>29960014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB 3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB2071L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG (Polyethylene glicol solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P7181-5X5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (solution 100x)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 100 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo TC Dishes 35 mm</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ET2035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100 mM</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECM0542D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 2.5% in HBSS</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB3051D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: a cybrid model

Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) gerçekleştiren mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin eksikliği, insan mitokondriyal bozukluklarının biyokimyasal belirtecidir. Genetik açıdan bakıldığında, OXPHOS benzersiz bir örneği temsil eder, çünkü iki farklı genetik sistemin tamamlanmasından kaynaklanır: nükleer DNA (nDNA) ve mitokondriyal DNA (mtDNA). Bu nedenle, OXPHOS defektleri nükleer ve mitokondriyal kodlu genleri etkileyen mutasyonlardan kaynaklanabilir.
King ve Attardi'nin 1989'da yayınlanan çığır açan çalışması, mtDNA'dan (rho0 olarak adlandırılan) tükenmiş insan hücre hatlarının, sözde "transmitokondrial sibridler" elde etmek için eksojen mitokondri ile yeniden doldurulabileceğini gösterdi. Mitokondriyal bozuklukları (MD'ler) olan hastalardan ve rho0 hücrelerinden çekirdeklerden türetilen mitokondri içeren bu sibridler sayesinde, bir kusurun mtDNA veya nDNA ile ilişkili olup olmadığını doğrulamak mümkündür. Bu sibridler ayrıca bir mutasyonun patojenitesini doğrulamak ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda sibrid üretimi, seçimi ve karakterizasyonunu açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Sibrid üretmek, 3 günlük laboratuvar çalışması artı bir seçim süresi (~ 2 hafta) ve klonların büyümesi için ek 1-2 hafta gerektirir. Kritik adımlar sitoplastların kalitesi ve seçim dönemidir. Sibridlerin morfolojisi rho0 donör hücrelerininkine benzer. Hücrelerin kimliğini doğrulamak için sibridlerde doğru mtDNA ve nDNA'nın atanması zorunludur. Örnek Şekil 2'de verilmiştir. Bu durumda, mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model at JoVE.com

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Siber üretim, herhangi bir yeni mitokondriyal DNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak ve atriplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek için hala en gelişmiş protokoldür. Bu teknik, hastanın nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal araştırma yapılmasına izin verir. Bu teknik, mitokondriyal DNA'nın bir mutasyonunun patojenitesinin doğrulanmasına izin verir.ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemeyi mümkün kılar Fibroblastları içeren 35 milimetrelik bulaşıkları kalsiyum ve magnezyum olmadan iki mililitre 1X PBS kullanarak iki kez yıkayın. Bulaşıkların dış yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve alkol buharlaşana kadar bekleyin. Kapakları bulaşıklardan ve vidalı kapakları şişelerden çıkarın.Her kabı kapağı baş aşağı olacak şekilde her 250 mililitrelik santrifüj şişesinin altına yerleştirin. Her şişeye yavaşça 32 mililitre çekirdeklenme ortamı ekleyin, böylece ortamın yemeğe girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin verin. Uzun bir cam mera pipeti kullanarak bulaşıklardaki kabarcıkları çıkarın ve ucu bir bunsen alevinde kıvırın.Her şişeyi vidalı kapakla kapatın ve santrifüje aktarın. 37 santigrat derecede 20 dakika santrifüj yapın ve 8.000 x G.Ortamı şişelerden aspire edin ve atın. Şişeleri daha önce% 70 etanol ile püskürtülen steril bir gazlı bez üzerinde ters çevirerek bulaşıkları çıkarın.Bulaşıkların dış yüzeyini ve kapaklarını% 70 etanol ile temizleyin ve etanol buharlaştıktan sonra bulaşıkları kapatın. Devam etmeden önce, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sitoplast oluşumunu kontrol edin. Sitokalasin tarafından indüklenen çekirdeklerinin ekstrüzyonu nedeniyle aşırı derecede uzatılmış fibroblastları arayın.Her 35 milimetrelik çanağa 1.000, 143 satır sıfır hücre ekleyin. % 5 FBS ile desteklenmiş iki mililitre kültür ortamında yeniden askıya alınır. 143 sıra sıfır hücreyi hayaletlerin üzerine yerleştirmek için bulaşıkları nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatöründe üç saat bekletin.Üç saatlik inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve atın. Aderans hücrelerini serum veya MEM olmadan iki mililitre DMEM yüksek glikoz ortamı ile iki kez yıkayın, ardından ortamı aspire edin ve atın. Hücrelere 500 mikrolitre polietilen glikol çözeltisi ekleyin ve tam olarak bir dakika inkübe edin.Polietilen glikol çözeltisini aspire edin ve atın. Hücreleri üç kez iki mililitre DMEM yüksek glikoz ile serumsuz veya MEM ile yıkayın. İki mililitre füzyon ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit ile inkübatörde 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.Kalan kültür tabaklarındaki hücreleri tripsinize edin Onları sayın ve bir veya daha fazla Petri kabına tohumlayın Klonlar ortaya çıkana kadar takviyeli kültürde çanak başına 50 ila 100 hücre ekleyin. Sonra birkaç gün büyümelerine izin verin. Bir stereo mikroskop kullanarak, klonları klonlama silindirleri veya pipet ucu ile Petri kabından alın.Farklı klonları bir araya getirmekten kaçınmaya çalışın ve bunları her biri 200 mikrolitre takviyeli kültür ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Cybridler, mitokondriyal miyopati, ensefalopati laktik asidoz ve inme benzeri ataklarla ilişkili en yaygın mitokondriyal DNA mutasyonlarından biri olan heteroplazmik M2343A2G'yi taşıyan bir hastadan türetilen fibroblastlardan başlayarak üretildi. Değişken sayıda tandem tekrarının analizi, siber DNA'nın, hastanın siber DNA'sının 143 B genomu ile değiştirilmesini doğrulayan sıfır sıralı hücrelerle aynı olduğunu gösterdi.Kısıtlama fragman uzunluğu polimorfizmi veya dizileme analizleri, mitokondriyal DNA mutasyonunun varlığını ve heteroplazmi yüzdesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolü denerken, nükleon ve mitokondriyal DNA'nın doğru genetik varlığının yanı sıra yeniden doldurulmuş sibridlerdeki mitokondriyal DNA miktarını doğrulamak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...