Name: in ovo intravascular injection in chicken embryos
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31972547). Nous apprécions la révision de Jing Wang et la voix off de Malik Donlic à la Washington State University, aux États-Unis.

Toutes les procédures impliquant le soin et l’utilisation d’animaux étaient conformes aux directives de l’Institut national de la santé des États-Unis (NIH Pub. n° 85-23, révisée en 1996) et les protocoles sur les embryons de poulet ont été approuvés par le Comité de gestion des animaux de laboratoire et d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université de Yangzhou, en Chine (n° 201803124).
1. Collecte et préparation des ovules fécondés
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	<li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research.">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation.">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+(Gallus+gallus)+embryos.">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol.">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4.">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521 (2021).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells.">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).</li></ol>

La méthode d’injection inovo-intravasculaire d’embryons de poulet est optimisée pour que des matériaux exogènes (vecteurs, viraux ou PGC) soient transférés dans l’embryon. Sur la base de cette méthode, nous avons construit des modèles d’embryons de poulet avec une surexpression ou une interférence génétique stable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Ces modèles bien établis prouvent la faisabilité...

Les embryons de poulet sont largement utilisés depuis des siècles dans des applications développementales, immunologiques, pathologiques et biologiques 1,2,3. Ils présentent de nombreux avantages inhérents par rapport aux autres modèles animaux dans l’étude de la toxicologie et de la biologie cellulaire4. Les embryons de poulet sont facilement accessibles et peuvent être manipulés in vitro et directement observés à n’importe quel stade de développement, ce qui fournit un système pratique de modèle de recherche sur les embryons.
En général, les méthodes actuelles d’administration d’embryons de poulet telles que l’électrotransfection et l’injection de cavité sous-germinale ont des limites telles que l’exigence d’un équipement spécialisé et d’un programme conçu, et l’inefficacité due à la présence de jaune et d’albumine 5,6,7. Nous montrons ici une méthode de manipulation simple et efficace pour délivrer des matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cela peut être un outil puissant utilisé dans l’étude de la biologie du développement. Les matières injectées se propagent à l’embryon entier par circulation sanguine. Au cours du développement précoce des embryons de poulet, les PGC pourraient migrer dans le sang, coloniser la crête génitale, puis se développer en gamètes, ce qui constitue un moyen précieux de délivrer des matériaux exogènes8. Maintenant, cette méthode a été largement utilisée dans l’étude de la fonction des gènes, de la biologie embryonnaire et du développement, et de la production de poulet chimérique et transgénique 9,10,11.
L’injection intravasculaire inovo dans des embryons de poulet est une méthode bien établie et couramment utilisée 12,13,14. Dans cet article, nous montrons une description complète de ce protocole, y compris les matériaux d’injection, les sites, la posologie et les résultats représentatifs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescence macro-microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12566014</td>
			<td>liposome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EGFP lentivirus vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>128652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo intravascular injection in chicken embryos

En tant que système modèle classique de biologie embryonnaire, l’embryon de poulet a été utilisé pour étudier le développement embryonnaire et la différenciation. L’administration de matériaux exogènes dans des embryons de poulet présente un grand avantage pour l’étude de la fonction des gènes, de la reproduction transgénique et de la préparation de chimères pendant le développement embryonnaire. Nous montrons ici la méthode d’injection intravasculaire inovo par laquelle des matériaux exogènes tels que des vecteurs plasmidiques ou des cellules germinales primordiales modifiées (PGC) peuvent être transférés dans des embryons de poulet donneurs à des stades précoces de développement. Les résultats montrent que l’injection intravasculaire à travers l’aorte dorsale et la tête permet aux matériaux injectés de diffuser dans l’embryon entier à travers le système circulatoire sanguin. Dans le protocole présenté, l’efficacité de l’introduction de plasmides exogènes et de vecteurs lentiviraux, ainsi que la colonisation des PGC exogènes injectés dans la gonade receveuse, ont été déterminées en observant la fluorescence dans les embryons. Cet article décrit les procédures détaillées de cette méthode, fournissant ainsi une excellente approche pour étudier la fonction des gènes, la biologie embryonnaire et du développement, et la production de poulet gonade-chimérique. En conclusion, cet article permettra aux chercheurs d’effectuer en injection ovo-intravasculaire de matériaux exogènes dans des embryons de poulet avec beaucoup de succès et de reproductibilité.

Nous montrons ici l’injection in ovo intravasculaire d’embryons de poulet. Un processus schématique de l’injection intravasculaire est illustré à la figure 1; dans notre étude, nous avons utilisé diverses solutions exogènes pour tester et vérifier l’injection.
Pour mieux visualiser les matériaux injectés, Trypan Blue (0,4%) a été injecté comme traceur dans l’embryon. On a observé que le traceur (bleu) diffusait vers l’embryon ...

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In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.

À Ovo Injection intravasculaire dans des embryons de poulet

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Bonjour, je suis Kai Jin de l’Université de Yangzhou. Au nom de notre groupe de recherche, je vais présenter un outil puissant de l’embryon de poulet dans la recherche sur le développement. L’embryon de poulet est un modèle de développement classique qui a été utilisé pour étudier le développement et la différenciation, en fait, les mesures étrangères du laboratoire en embryons de poulet sont un outil précieux pour la biologie du développement, comme la transfection de gènes, la reproduction transgénique et la préparation transmurale gonadique.Dans notre laboratoire, nous avons établi les méthodes d’injection de type mu, mais pour de nombreux chercheurs, les détails de l’injection ne sont pas clairs et difficiles à aligner. Donc, dans cette vidéo, nous allons montrer les détails de l’injection vasculaire au stade précoce du développement de l’embryon de poulet dans ovo. N’hésitez pas à nous contacter si cela vous intéresse.Ici, nous montrons les détails du protocole. Collecte et préparation des ovules fécondés. Tout d’abord, contrairement aux mammifères, le poulet a des millions de follicules dans un seul ovaire, mais seuls quelques-uns de ces follicules sont assez matures pour ovuler.Chaque follicule contient un ovocyte ou une cellule germinale. Dès que le follicule mûrit et libère son jaune, il est incorporé dans l’entonnoir de la trompe de Fallope. Lorsque le follicule pénètre dans l’abdomen jugulaire de l’oviducte, le sperme se lie à l’œuf dans le corps de la poule et le calcium dans le corps de la poule forme une coquille qui enveloppe l’œuf fécondé formant un œuf à coquille molle dans le corps.Les coquilles de calcium s’épaississent progressivement jusqu’à ce que l’œuf soit produit. Recueillez l’œuf fécondé, appelé académiquement œufs embryonnaires et placez-les soigneusement sur un support dans un incubateur à 37,8 degrés Celsius et 60% d’humidité. Les embryons sont incubés dans des conditions appropriées.Après deux jours d’incubation, de petits points rouges pulsés appelés cœurs primordiaux apparaissent. Ce processus est appelé battement de cerise. Vers 2,5 jours, les vaisseaux sanguins sont visibles et les segments du cœur et du corps se sont formés.Préparation d’aiguilles et de plasmides. Nous utilisons des capillaires en verre comme aiguilles. Avant l’injection, préparez des capillaires en verre d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre intérieur de 0,6 millimètre.Les matériaux exogènes sont généralement des plasmides, des lentivirus emballés et des cellules germinales primordiales, ou PGC. Dans cette vidéo, nous utilisons le bleu trypan pour montrer la trace des matériaux injectés. Fenêtrage. Avant d’exposer les embryons, nous devons stériliser les embryons pour éviter la contamination germinale.Cela se fait en essuyant doucement la surface des embryons avec une boule de coton à 75% d’alcool sur le site de l’ouverture de l’œuf. Après la désinfection, tapotez doucement l’extrémité émoussée de la coquille d’œuf avec une pince et clipsez soigneusement un trou de 0,5 centimètre sur 0,5 centimètre à la surface de la coquille de l’œuf avec la pince pour exposer l’embryon. Injection intravasculaire in-ovo.Regardez la vue sous le microscope, ajustez la mise au point du microscope pour d’abord localiser l’embryon, puis trouvez les vaisseaux sanguins de l’embryon de poulet prêts à être injectés. Dirigez l’aiguille avec la substance exogène vers le vaisseau sanguin, en notant que l’aiguille est parallèle au vaisseau sanguin injecté. Insérez doucement l’aiguille dans le vaisseau sanguin, puis allumez la pompe à air.À ce stade, la substance étrangère pénètre dans l’artère et, avec le battement du cœur, circule vers l’embryon par l’artère, puis vers la veine. Il existe deux types d’injections vasculaires. La première est une injection de tête où la substance étrangère est injectée à partir d’une veine dans la tête de l’embryon et retourne dans le cœur.L’autre est une injection aortique dorsale où la substance étrangère circule vers l’embryon en battant le cœur. Avec le battement du cœur embryonnaire et la circulation du sang, nous pouvons clairement voir que la matière étrangère est reçue par les capillaires à l’extrémité de l’artère, dans la veine, puis retourne à l’embryon de la veine, indiquant que la matière étrangère injectée est effectivement livrée à chaque partie de l’embryon. Après l’injection, retirez l’œuf du stéréomicroscope, coupez un morceau de ruban médical de trois centimètres de long avec de petits ciseaux et attachez le ruban à l’ouverture.Grattez doucement le ruban adhésif avec les ciseaux pour extraire les bulles d’air, puis coupez un autre morceau de ruban adhésif pour sceller l’ouverture en croix. Après avoir scellé l’ouverture, les embryons injectés sont soigneusement replacés dans l’incubateur. Ici, nous montrons les images représentatives d’embryons de poulet après l’injection.La première image montre le résultat de l’injection de plasmide de lentivirus. La fluorescence verte sous un microscope à fluorescence stéréoscopique indique l’expression réussie du plasmide injecté dans les embryons. Cela suggère la faisabilité de l’injection intravasculaire de plasmides dans des embryons de poulet.La deuxième image montre les résultats de l’injection de PGC. Les PGC ont été étiquetés avec rfp. Sur cette photo, nous avons pu voir les PGC injectés qui sont les points rouges ici, situés dans la gonade des destinataires.Cela indique que les PGC donneurs ont pu entrer et coloniser efficacement la gonade des receveurs. En conclusion, ce protocole présente le processus d’injection in-ovo-intravasculaire de matériaux exogènes, de plasmides ou de PGC dans des embryons de poulet. La méthode montrée ici est facile à suivre et à apprendre et vaut l’application dans de nombreux domaines.C’est tout ce que j’aimerais partager avec vous. J’espère que cette approche facilitera votre travail en tant qu’outil de recherche puissant dans la mise en place d’embryons de poulet et la biologie du développement. Merci d’avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos recherches.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

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Optimisé<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement

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Recherche

Biologie du développement

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