Name: in ovo intravascular injection in chicken embryos
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31972547) unterstützt. Wir schätzen das Lektorat von Jing Wang und das Voiceover von Malik Donlic an der Washington State University, USA.

Alle Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren beinhalten, entsprachen den Richtlinien des U.S. National Institute of Health (NIH Pub. Nr. 85-23, überarbeitet 1996) und die Hühnerembryo-Protokolle wurden vom Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee der Yangzhou University, China, genehmigt (Nr. 201803124).
1. Entnahme und Aufbereitung befruchteter Eier
HINWEIS: Im Gegensatz zu Säugetieren hat das Huhn Millione...

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	<li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research.">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens.">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li><li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development.">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li><li>Han, J. Y., Lee, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation.">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+(Gallus+gallus)+embryos.">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol.">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4.">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521 (2021).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells.">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).</li></ol>

Die Methode der intravaskulären In-Ovo-Injektion von Hühnerembryonen ist für exogene Materialien (Vektor-, Virus- oder PGCs) optimiert, die in den Embryo übertragen werden sollen. Basierend auf dieser Methode konstruierten wir Hühnerembryomodelle mit stabiler Genüberexpression oder -interferenz (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.). 17,18,19. Diese etablierten Modelle belegen die Machbarkeit dieses Ansatzes. Darüber hinaus h...

Hühnerembryonen werden seit Jahrhunderten in entwicklungspolitischen, immunologischen, pathologischen und anderen biologischen Anwendungen eingesetzt 1,2,3. Sie haben viele inhärente Vorteile gegenüber anderen Tiermodellen in der Erforschung der Toxikologie und Zellbiologie4. Hühnerembryonen sind leicht zugänglich und können in vitro manipuliert und in jedem Entwicklungsstadium direkt beobachtet werden, was ein praktisches Modellsystem für die Embryonenforschung bietet.
Im Allgemeinen haben aktuelle Hühnerembryo-Abgabemethoden wie Elektrotransfektion und Subkeimkavitäteninjektion Einschränkungen wie die Anforderung einer speziellen Ausrüstung und eines entworfenen Programms sowie Ineffizienz aufgrund des Vorhandenseins von Eigelb und Eiweiß 5,6,7. Hier zeigen wir eine einfache und effiziente Handhabungsmethode, um exogene Materialien in Hühnerembryonen zu bringen. Dies kann ein mächtiges Werkzeug sein, das beim Studium der Entwicklungsbiologie verwendet wird. Die injizierten Materialien breiten sich über den Blutkreislauf auf den gesamten Embryo aus. Während der frühen Entwicklung von Hühnerembryonen konnten die PGCs durch Blut wandern, den Genitalkamm besiedeln und sich dann zu Gameten entwickeln, die einen wertvollen möglichen Weg zur Abgabe exogener Materialien bieten8. Jetzt wurde diese Methode bei der Untersuchung der Genfunktion, der Embryonen- und Entwicklungsbiologie sowie der chimären und transgenen Hühnerproduktionweit verbreitet 9,10,11.
Bei der intravaskulären Injektion in Hühnerembryonen ist eine etablierte und häufig verwendete Methode12,13,14. In diesem Artikel zeigen wir eine umfassende Beschreibung dieses Protokolls, einschließlich Injektionsmaterialien, Stellen, Dosierung und repräsentativer Ergebnisse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescence macro-microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12566014</td>
			<td>liposome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EGFP lentivirus vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>128652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo intravascular injection in chicken embryos

Als klassisches Modellsystem der Embryonenbiologie wurde der Hühnerembryo verwendet, um die Entwicklung und Differenzierung von Embryonen zu untersuchen. Die Abgabe exogener Materialien in Hühnerembryonen hat einen großen Vorteil für die Untersuchung der Genfunktion, der transgenen Zucht und der Chimärenvorbereitung während der Embryonalentwicklung. Hier zeigen wir die Methode der intravaskulären In-Ovo-Injektion , bei der exogene Materialien wie Plasmidvektoren oder modifizierte primordiale Keimzellen (PGCs) in frühen Entwicklungsstadien in Spenderhühnerembryonen übertragen werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass die intravaskuläre Injektion durch die dorsale Aorta und den Kopf es ermöglicht, injizierte Materialien durch das Blutkreislaufsystem in den gesamten Embryo zu diffundieren. Im vorgestellten Protokoll wurden die Wirksamkeit der exogenen Plasmid- und Lentiviralvektoreinführung sowie die Besiedlung injizierter exogener PGCs in der Empfängergonade durch Beobachtung der Fluoreszenz in den Embryonen bestimmt. Dieser Artikel beschreibt detaillierte Verfahren dieser Methode und bietet damit einen hervorragenden Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion, der Embryonen- und Entwicklungsbiologie sowie der Gonaden-chimären Hühnerproduktion. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Artikel es den Forschern ermöglichen wird, bei der intravaskulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen mit großem Erfolg und Reproduzierbarkeit durchzuführen.

Wir zeigen hier die in ovo intravaskuläre Injektion von Hühnerembryonen. Ein schematischer Ablauf der intravaskulären Injektion ist in Abbildung 1 dargestellt; In unserer Studie haben wir verschiedene exogene Lösungen verwendet, um die Injektion zu testen und zu verifizieren.
Um die injizierten Materialien besser sichtbar zu machen, wurde Trypan Blue (0,4%) als Tracer in den Embryo injiziert. Es wurde beobachtet, dass der Tracer (blau) entweder</e...

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In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, zu beschreiben, wie bei der intrazellulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die Entwicklungsbiologie von Hühnerembryonen zu untersuchen.

In Ovo Intravaskuläre Injektion in Hühnerembryonen

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Hallo, ich bin Kai Jin von der Yangzhou University. Im Auftrag unserer Forschungsgruppe werde ich ein mächtiges Werkzeug des Hühnerembryos in der Entwicklungsforschung vorstellen. Hühnerembryo ist ein klassisches Entwicklungsmodell, das verwendet wurde, um Entwicklung und Differenzierung zu untersuchen, in der Tat sind die Fremdmessungen des Labors in Hühnerembryonen ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklungsbiologie, wie Gentransfektion, transgene Züchtung und die gonadale transmurale Vorbereitung.In unserem Labor haben wir die Mu-Typ-Injektionsmethoden etabliert, aber für viele Forscher ist das Detail der Injektion unklar und schwer zu bestimmen. In diesem Video werden wir die Details der vaskulären Injektion in einem frühen Stadium der Entwicklung des Hühnerembryos in ovo zeigen. Zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren, wenn Sie daran interessiert sind.Hier zeigen wir die Details des Protokolls. Entnahme und Zubereitung befruchteter Eier. Erstens, im Gegensatz zu Säugetieren hat das Huhn Millionen von Follikeln in einem einzigen Eierstock, aber nur wenige dieser Follikel sind reif genug, um zu ovulieren.Jeder Follikel enthält eine Eizelle oder Keimzelle. Sobald der Follikel reift und sein Eigelb freigibt, wird er in den Trichter des Eileiters eingebaut. Wenn der Follikel in den Jugularabdomen des Eileiters eintritt, bindet sich der Samen an das Ei im Körper der Henne und das Kalzium im Körper der Henne bildet eine Schale, die das befruchtete Ei umhüllt und ein weiches Schalenei im Körper bildet.Die Kalziumschalen verdicken sich allmählich, bis das Ei produziert ist. Sammeln Sie das befruchtete Ei, akademisch Embryoneier genannt, und legen Sie es ordentlich auf ein Gestell in einem Inkubator bei 37,8 Grad Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit. Die Embryonen werden unter geeigneten Bedingungen inkubiert.Nach zweitägigen Inkubationen erscheinen kleine pulsierende rote Punkte, die als Urherzen bezeichnet werden. Dieser Vorgang wird als Kirschschlag bezeichnet. Nach etwa 2,5 Tagen sind die Blutgefäße sichtbar und die Herz- und Körpersegmente haben sich gebildet.Nadel- und Plasmidpräparation. Wir verwenden Glaskapillaren als Nadeln. Vor der Injektion bereiten Sie Glaskapillaren mit dem Außendurchmesser von einem Millimeter und dem Innendurchmesser von 0,6 Millimetern vor.Die exogenen Materialien sind in der Regel Plasmide, verpackte Lentiviren und primordiale Keimzellen oder PGCs. In diesem Video verwenden wir das Trypanblau, um die Spuren von eingespritzten Materialien zu zeigen. Windowing. Bevor wir die Embryonen freilegen, müssen wir die Embryonen sterilisieren, um eine Keimkontamination zu verhindern.Dies geschieht, indem die Oberfläche der Embryonen vorsichtig mit einem 75% Alkohol-Wattebausch an der Stelle der Eiöffnung abgewischt wird. Klopfen Sie nach der Desinfektion vorsichtig mit einer Pinzette auf das stumpfe Ende der Eierschale und befestigen Sie vorsichtig ein 0,5 Zentimeter mal 0,5 Zentimeter großes Loch auf der Oberfläche der Eierschale mit der Pinzette, um den Embryo freizulegen. In-ovo intravaskuläre Injektion.Schauen Sie sich die Ansicht unter dem Mikroskop an, stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, um zuerst den Embryo zu lokalisieren, und finden Sie dann die Blutgefäße des Hühnerembryos zur Injektion bereit. Zielen Sie die Nadel mit der exogenen Substanz auf das Blutgefäß und beachten Sie, dass die Nadel parallel zu dem zu injizierenden Blutgefäß verläuft. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Blutgefäß ein und schalten Sie dann die Luftpumpe ein.An diesem Punkt gelangt die Fremdsubstanz in die Arterie und zirkuliert mit dem Schlagen des Herzens zurück zum Embryo durch die Arterie und dann zur Vene. Es gibt zwei Arten von vaskulären Injektionen. Die eine ist eine Kopfinjektion, bei der die Fremdsubstanz aus einer Vene im Kopf des Embryos injiziert wird und zurück in das Herz fließt.Die andere ist eine dorsale Aorteninjektion, bei der die Fremdsubstanz mit dem Schlagen des Herzens zum Embryo zirkuliert. Mit dem Schlagen des embryonalen Herzens und der Zirkulation von Blut können wir deutlich sehen, dass das Fremdmaterial von den Kapillaren am Ende der Arterie, in die Vene aufgenommen wird und dann aus der Vene zum Embryo zurückkehrt, was darauf hindeutet, dass das injizierte Fremdmaterial effektiv an jeden Teil des Embryos abgegeben wird. Entfernen Sie nach der Injektion das Ei aus dem Stereomikroskop, schneiden Sie ein drei Zentimeter langes Stück medizinisches Klebeband mit einer kleinen Schere ab und befestigen Sie das Band an der Öffnung.Kratzen Sie das Band vorsichtig mit der Schere, um Luftblasen herauszuquetschen, und schneiden Sie dann ein weiteres Stück Klebeband, um die Öffnung zu einem Kreuz zu versiegeln. Nach dem Verschließen der Öffnung werden die injizierten Embryonen vorsichtig wieder in den Inkubator gelegt. Hier zeigen wir die repräsentativen Bilder von Hühnerembryonen nach der Injektion.Das erste Bild zeigt das Ergebnis der Lentivirus-Plasmid-Injektion. Die grüne Fluoreszenz unter einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop zeigt die erfolgreiche Expression von injiziertem Plasmid in Embryonen an. Dies deutet auf die Machbarkeit der intravaskulären Injektion von Plasmiden in Hühnerembryonen hin.Das zweite Bild zeigt die Ergebnisse der PGC-Injektion. Die PGCs wurden mit RFP gekennzeichnet. Auf diesem Bild konnten wir die injizierten PGCs sehen, die hier die roten Punkte sind, die sich in der Gonade des Empfängers befinden.Dies deutet darauf hin, dass die Geber-PGCs in der Lage waren, effektiv in die Gonade der Empfänger einzudringen und zu kolonisieren. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll den Prozess der intravaskulären In-Ovo-Injektion von exogenen Materialien, Plasmiden oder PGCs in Hühnerembryonen dar. Die hier gezeigte Methode ist leicht zu befolgen und zu erlernen und lohnt sich die Anwendung in vielen Bereichen.Das ist alles, was ich mit Ihnen teilen möchte. Ich hoffe, dass dieser Ansatz Ihre Arbeit als leistungsfähiges Forschungsinstrument beim Setzen von Hühnerembryonen und der Entwicklungsbiologie erleichtern wird. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben und viel Erfolg bei Ihrer Recherche.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...