Name: in ovo intravascular injection in chicken embryos
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(31972547)の支援を受けた。Jing Wangによるコピーエディットと、米国ワシントン州立大学のMalik Donlicによるナレーションに感謝します。

動物の世話と使用に関するすべての手順は、米国国立衛生研究所のガイドライン(NIH Pub. No. 85-23、1996年改訂)に準拠し、ニワトリ胚プロトコルは、中国揚州大学の実験動物管理および実験動物倫理委員会(No.201803124)によって承認されました。
1. 受精卵の採取と準備
注:哺乳類とは異なり、鶏肉は単一の卵巣に何百万もの卵胞を持っていますが...

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	<li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research.">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+as+a+model+system+for+analyzing+mechanisms+of+development.">The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development.</a> Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).</li><li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo:+a+preclinical+model+for+understanding+ischemia-reperfusion+mechanism.">Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).</li><li>Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+embryo+as+an+in+vivo+experimental+model+for+drug+testing:+Advantages+and+limitations.">The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations.</a> Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens.">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li><li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development.">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li><li>Han, J. Y., Lee, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+chicken+primordial+germ+cells+and+their+application+in+transgenesis.">Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis.</a> Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).</li><li>Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+chicken+primordial+germ+cells+isolated+from+embryonic+blood+and+production+of+germline+chimaeric+chickens.">Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens.</a> Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization+and+germline+chimera+preparation+of+primordial+germ+cells+from+the+Chinese+Meiling+chicken.">Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken.</a> Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation.">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+(Gallus+gallus)+embryos.">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol.">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4.">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521 (2021).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells.">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).</li></ol>

ニワトリ胚のin ovo血管内注射の方法は、外因性物質(ベクター、ウイルス性、またはPGC)が胚に移植されるように最適化される。この手法に基づき、安定した遺伝子過剰発現または干渉(SpinZ、JUN、UBE2Iなど)を有するニワトリ胚モデルを構築した。17,18,19。これらの確立されたモデルは、このアプローチの実現可能性を?...

ニワトリ胚は、発生学的、免疫学的、病理学的、および他の生物学的用途において何世紀にもわたって広く使用されてきた1,2,3。それらは、毒物学および細胞生物学の研究において、他の動物モデルよりも多くの固有の利点を有する4。ニワトリの胚は簡単にアクセスでき、インビトロで操作し、任意の発生段階で直接観察することができ、便利な胚研究モデルシステムを提供します。
一般に、エレクトロトランスフェクションや胚腔下注射などの現在のニワトリ胚送達方法は、専門機器や設計されたプログラムの要件、卵黄や卵白の存在による非効率性などの制限があります5,6,7。ここでは、外因性物質をニワトリ胚に送達するための簡単で効率的な取り扱い方法を示す。これは、発生生物学の研究に使用される強力なツールとなり得ます。注入された物質は、血液循環を介して胚全体に広がる。ニワトリ胚の初期発生の間、PGCは血液中を移動し、生殖器隆起に定着し、配偶子に発達し、外因性物質8を送達するための貴重な可能な経路を提供する。現在、この方法は、遺伝子機能、胚および発生生物学、ならびにキメラおよびトランスジェニックニワトリ産生の研究において広く使用されている9、10、11。
ニワトリ胚における卵管内注射において、十分に確立され、一般的に使用される方法12、13、14である。この論文では、注射材料、部位、投与量、および代表的な結果を含むこのプロトコルの包括的な説明を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescence macro-microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12566014</td>
			<td>liposome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EGFP lentivirus vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>128652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo intravascular injection in chicken embryos

胚生物学の古典的なモデルシステムとして、ニワトリ胚は胚の発生と分化を調べるために使用されてきた。外因性物質をニワトリ胚に送達することは、胚発生中の遺伝子機能、トランスジェニック育種、およびキメラ調製を研究する上で大きな利点を有する。ここでは、プラスミドベクターや改変始原生殖細胞(PGC)などの外因性物質を発生初期の段階でドナーニワトリ胚に移入することができる in ovo 血管内注射の方法を示す。結果は、背側大動脈および頭部を介した血管内注射が、注入された物質が血液循環系を介して胚全体に拡散することを可能にすることを示している。提示されたプロトコールにおいて、外因性プラスミドおよびレンチウイルスベクター導入の有効性、ならびにレシピエント生殖巣における注射された外因性PGCのコロニー形成を、胚における蛍光を観察することによって決定した。この記事では、この方法の詳細な手順を説明し、それによって遺伝子機能、胚および発生生物学、および生殖腺キメラニワトリ産生を研究するための優れたアプローチを提供する。結論として、この記事は、研究者が大きな成功と再現性でニワトリ胚への外因性物質の 卵管 内注射を行うことを可能にします。

ここではニワトリ胚の 卵 管内注射を示す。血管内注射の概略プロセスを 図1に示す。私たちの研究では、注射をテストおよび検証するためにさまざまな外因性溶液を使用しました。
注入された材料をよりよく視覚化するために、トリパンブルー(0.4%)をトレーサーとして胚に注入した。トレーサー(青色)は、背側大動脈または頭部注射のいず?...

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In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において どのように行うかを記述することである。このアプローチは、ニワトリ胚の発生生物学を研究するのに非常に有用である。

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

こんにちは、揚州大学のカイ・ジンです。私たちの研究グループを代表して、私は発生研究におけるニワトリ胚の強力なツールを提示するつもりです。ニワトリ胚は、発生と分化を調査するために使用されてきた古典的な発生モデルであり、実際、ニワトリ胚への実験室の無関係な対策は、遺伝子トランスフェクション、トランスジェニック育種、生殖腺経壁標示などの発生生物学のための貴重なツールです。私たちの研究室では、μ型の注入方法を確立していますが、多くの研究者にとって、注射の詳細は不明瞭でラインが難しいです。そこでこのビデオでは、ovoでのニワトリ胚発生の初期段階における血管注射の詳細を紹介します。あなたがそれに興味があるならば、私達に連絡すること自由に感じなさい。ここで、プロトコルの詳細を示す。受精卵の収集と準備。第一に、哺乳類とは異なり、鶏肉は単一の卵巣に何百万もの卵胞を持っていますが、これらの卵胞のほんの一部だけが排卵するのに十分成熟しています。各卵胞は1つの卵母細胞または生殖細胞を含む。卵胞が成熟して卵黄を放出するとすぐに、卵管の漏斗に取り込まれます。卵胞が卵管の頸部腹部に入ると、精液は鶏の体内の卵に結合し、鶏の体内のカルシウムは受精卵を包む殻を形成し、体内で柔らかい殻の卵を形成します。カルシウムの殻は、卵が生産されるまで徐々に厚くなります。学術的には胚卵と呼ばれる受精卵を集め、摂氏37.8度、湿度60%のインキュベーター内のラックにきれいに置きます。胚を適切な条件下でインキュベートする。2日間の孵化後、原始的な心臓と呼ばれる小さな脈打つ赤い点が現れます。このプロセスはチェリービートと呼ばれます。約2.5日で、血管が見え、心臓と体のセグメントが形成されています。針およびプラスミド調製。針としてガラス毛細血管を使用しています。注入の前に、外径1ミリメートル、内径0.6ミリメートルのガラス毛細血管を準備する。外因性物質は、通常、プラスミド、パッケージングされたレンチウイルスおよび始原生殖細胞、またはPGCである。このビデオでは、トリパンブルーを使用して、注入された材料の痕跡を示します。ウィンドウ。胚を暴露する前に, 我々は、細菌の汚染を防ぐために胚を滅菌する必要があります.これは、卵の開口部の部位で75%アルコールの綿球で胚の表面を静かに拭くことによって行われます。消毒後、卵殻の鈍い端を鉗子で静かに叩き、卵殻の表面にある0.5センチ×0.5センチメートルの穴を鉗子で慎重にクリップして胚を露出させます。インオボ血管内注射。顕微鏡の下のビューを見て、顕微鏡の焦点を調整して最初に胚を見つけ、次に注射の準備ができているニワトリ胚の血管を見つけます。外因性物質を含む針を血管に向け、針が注射される血管と平行であることに注意する。血管に針をそっと差し込み、エアポンプの電源を入れます。この時点で、異物は動脈に入り、心臓の鼓動とともに、動脈を通って胚に戻り、次いで静脈に戻る。血管注射には2種類あります。一つは、胚の頭の静脈から異物が注入され、心臓に逆流する頭部注射です。もう1つは、心臓の鼓動とともに異物が胚に循環する背側大動脈注射です。胚性心臓の鼓動と血液の循環により、異物が動脈の端にある毛細血管によって静脈に受容され、次いで静脈から胚に戻ることがはっきりとわかり、注入された異物が胚の各部分に効果的に送達されることを示す。注射後、実体顕微鏡から卵を取り出し、小さなはさみで長さ3センチの医療用テープを切り取り、テープを開口部に貼り付けます。はさみでテープを優しくこすり取って気泡を絞り出し、別のテープを切って開口部を十字に密封します。開口部を密封した後、注入された胚を慎重にインキュベーターに戻す。ここでは、注射後のニワトリ胚の代表的な画像を示す。第1の画像は、レンチウイルスプラスミド注入の結果を示す。実体蛍光顕微鏡下での緑色蛍光は、胚における注入プラスミドの発現の成功を示す。このことは、ニワトリ胚へのプラスミドの血管内注射の実現可能性を示唆している。2番目の画像は、PGC注射の結果を示す。PGCにはRFPのラベルが付けられていた。この写真では、受信者の生殖腺にある赤い点である注入されたPGCを見ることができました。これは、ドナーPGCがレシピエントの生殖腺に効果的に侵入し、植民地化することができたことを示しています。結論として、このプロトコルは、ニワトリ胚への外因性物質、プラスミドまたはPGCのin-ovo血管内注射のプロセスを提示する。ここで示した方法は、従うのが簡単で、学ぶのが簡単で、多くの分野で応用する価値があります。これが私があなたと共有したいすべてです。このアプローチが、ニワトリの胚の設定と発生生物学における強力な研究ツールとしてのあなたの仕事を促進することを願っています。このビデオを見ていただきありがとうございます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

最適化された<em&gt;元OVO</em&gt;開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

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鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

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チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

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小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em&gt;例OVO</emニワトリ初期胚の&gt;タイムラプスイメージング

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

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鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

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