Name: in ovo intravascular injection in chicken embryos
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31972547). Agradecemos la edición de Jing Wang y la voz en off de Malik Donlic en la Universidad Estatal de Washington, Estados Unidos.

Todos los procedimientos relacionados con el cuidado y el uso de animales se ajustaron a las directrices del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH Pub. No. 85-23, revisado en 1996) y los protocolos de embriones de pollo fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales experimentales y manejo de animales de laboratorio de la Universidad de Yangzhou, China (No.201803124).
1. Recolección y preparación de óvulos fertilizados
NOTA:...

<ol>
	<li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research.">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+as+a+model+system+for+analyzing+mechanisms+of+development.">The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development.</a> Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).</li><li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo:+a+preclinical+model+for+understanding+ischemia-reperfusion+mechanism.">Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).</li><li>Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+embryo+as+an+in+vivo+experimental+model+for+drug+testing:+Advantages+and+limitations.">The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations.</a> Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).</li><li>van de Lavoir, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+of+genetically+modified+primordial+germ+cells.">Germline transmission of genetically modified primordial germ cells.</a> Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).</li><li>Ballantyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+primordial+germ+cells+are+bipotent+for+male+or+female+gametogenesis.">Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).</li><li>Park, T. S., Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens.">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li><li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development.">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li><li>Han, J. Y., Lee, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation.">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+(Gallus+gallus)+embryos.">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol.">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4.">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521 (2021).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells.">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).</li></ol>

El método de inyección in ovo intravascular de embriones de pollo está optimizado para materiales exógenos (vectores, virales o PGC) que se transfieren al embrión. Basándonos en este método, construimos modelos de embriones de pollo con sobreexpresión o interferencia genética estable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Estos modelos bien establecidos demuestran la viabilidad de este enfoque. Además, no solo t...

Los embriones de pollo se han utilizado ampliamente durante siglos en aplicaciones biológicas, inmunológicas, patológicas y de desarrollo 1,2,3. Tienen muchas ventajas inherentes sobre otros modelos animales en el estudio de la toxicología y la biología celular4. Los embriones de pollo son fácilmente accesibles y pueden manipularse in vitro y observarse directamente en cualquier etapa del desarrollo, lo que proporciona un práctico sistema de modelo de investigación embrionaria.
En general, los métodos actuales de administración de embriones de pollo, como la electrotransfección y la inyección de cavidad subgerminal, tienen limitaciones como el requisito de equipos especializados y un programa diseñado, y la ineficiencia debido a la presencia de yema y albúmina 5,6,7. Aquí mostramos un método de manejo simple y eficiente para entregar materiales exógenos en embriones de pollo. Esta puede ser una herramienta poderosa utilizada en el estudio de la biología del desarrollo. Los materiales inyectados se propagan a todo el embrión a través de la circulación sanguínea. Durante el desarrollo temprano de los embriones de pollo, los PGC podrían migrar a través de la sangre, colonizar la cresta genital y luego convertirse en gametos, que proporcionan un valioso camino posible para entregar materiales exógenos8. Ahora, este método ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos y transgénicos 9,10,11.
La inyección intravascular in ovo en embriones de pollo es un método bien establecido y de uso común 12,13,14. En este documento, mostramos una descripción completa de este protocolo que incluye materiales de inyección, sitios, dosis y resultados representativos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorescence macro-microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12566014</td>
			<td>liposome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EGFP lentivirus vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>128652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo intravascular injection in chicken embryos

Como un sistema modelo clásico de biología embrionaria, el embrión de pollo se ha utilizado para investigar el desarrollo embrionario y la diferenciación. La entrega de materiales exógenos en embriones de pollo tiene una gran ventaja para estudiar la función génica, la reproducción transgénica y la preparación de quimeras durante el desarrollo embrionario. Aquí mostramos el método de inyección intravascular in ovo mediante el cual los materiales exógenos como los vectores plásmidos o las células germinales primordiales modificadas (PGC) pueden transferirse a embriones de pollo de donantes en etapas tempranas de desarrollo. Los resultados muestran que la inyección intravascular a través de la aorta dorsal y la cabeza permite que los materiales inyectados se difundan en todo el embrión a través del sistema circulatorio sanguíneo. En el protocolo presentado, la eficacia de la introducción de plásmidos exógenos y vectores lentivirales, y la colonización de PGC exógenos inyectados en la gónada receptora, se determinaron mediante la observación de fluorescencia en los embriones. Este artículo describe procedimientos detallados de este método, proporcionando así un excelente enfoque para estudiar la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos de gónadas. En conclusión, este artículo permitirá a los investigadores realizar in ovo inyección intravascular de materiales exógenos en embriones de pollo con gran éxito y reproducibilidad.

Mostramos aquí la inyección intravascular in ovo de embriones de pollo. En la Figura 1 se muestra un proceso esquemático de la inyección intravascular; en nuestro estudio, utilizamos varias soluciones exógenas para probar y verificar la inyección.
Para visualizar mejor los materiales inyectados, se inyectó Trypan Blue (0,4%) como trazador en el embrión. Se observó que el marcador (azul) se difunde a todo el embrión a través de la circu...

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In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Hola, soy Kai Jin de la Universidad de Yangzhou. En nombre de nuestro grupo de investigación voy a presentar una poderosa herramienta del embrión de pollo en la investigación del desarrollo. El embrión de pollo es un modelo de desarrollo clásico que se ha utilizado para investigar el desarrollo y la diferenciación, de hecho, las medidas extrañas del laboratorio en embriones de pollo son una herramienta valiosa para la biología del desarrollo, como la transfección genética, la reproducción transgénica y la preparación transmural gonadal.En nuestro laboratorio, hemos establecido los métodos de inyección de tipo mu, pero para muchos investigadores, el detalle de la inyección no está claro y es difícil de alinear. Así que en este video, vamos a mostrar los detalles de la inyección vascular durante la etapa temprana del desarrollo embrionario de pollo en ovo. No dude en ponerse en contacto con nosotros si está interesado en ello.Aquí, mostramos los detalles del protocolo. Recolección y preparación de óvulos fertilizados. Primero, a diferencia de los mamíferos, el pollo tiene millones de folículos en un solo ovario, pero solo unos pocos de estos folículos son lo suficientemente maduros como para ovular.Cada folículo contiene un ovocito o célula germinal. Tan pronto como el folículo madura y libera su yema, se incorpora al embudo de la trompa de Falopio. A medida que el folículo entra en el abdomen yugular del oviducto, el semen se une al huevo en el cuerpo de la gallina y el calcio en el cuerpo de la gallina forma una cáscara que envuelve el huevo fertilizado formando un huevo de cáscara suave en el cuerpo.Las cáscaras de calcio se espesan gradualmente hasta que se produce el huevo. Recoja el óvulo fertilizado, académicamente llamado huevos embrionarios y colóquelos cuidadosamente en un estante en una incubadora a 37.8 grados Celsius y 60% de humedad. Los embriones se incuban en condiciones adecuadas.Después de dos días de incubación, aparecen pequeños puntos rojos pulsantes llamados corazones primordiales. Este proceso se llama batido de cerezas. Alrededor de los 2,5 días, los vasos sanguíneos son visibles y se han formado los segmentos del corazón y el cuerpo.Preparación de agujas y plásmidos. Utilizamos capilares de vidrio como agujas. Antes de la inyección, prepare capilares de vidrio con el diámetro exterior de un milímetro y el diámetro interno de 0,6 milímetros.Los materiales exógenos suelen ser plásmidos, lentivirus empaquetados y células germinales primordiales, o PGC. En este video, usamos el azul tripano para mostrar el rastro de los materiales inyectados. Ventanas. Antes de exponer los embriones, necesitamos esterilizar los embriones para evitar la contaminación por gérmenes.Esto se hace limpiando suavemente la superficie de los embriones con una bola de algodón con 75% de alcohol en el sitio de la abertura del huevo. Después de la desinfección, golpee suavemente el extremo romo de la cáscara del huevo con fórceps y corte cuidadosamente un agujero de 0,5 centímetros por 0,5 centímetros en la superficie de la cáscara del huevo con las pinzas para exponer el embrión. Inyección intravascular in-ovo.Mire la vista bajo el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para localizar primero el embrión y luego encuentre los vasos sanguíneos del embrión de pollo listos para la inyección. Apunte la aguja con la sustancia exógena al vaso sanguíneo, observando que la aguja es paralela al vaso sanguíneo que se inyecta. Inserte la aguja suavemente en el vaso sanguíneo y luego encienda la bomba de aire.En este punto, la sustancia extraña ingresa a la arteria y, con el latido del corazón, circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena. Hay dos tipos de inyecciones vasculares. La primera es una inyección en la cabeza donde la sustancia extraña se inyecta desde una vena en la cabeza del embrión y fluye de regreso al corazón.La otra es una inyección aórtica dorsal donde la sustancia extraña circula al embrión con el latido del corazón. Con el latido del corazón embrionario y la circulación de la sangre podemos ver claramente que el material extraño es recibido por los capilares al final de la arteria, en la vena y luego regresa al embrión desde la vena, lo que indica que el material extraño inyectado se entrega efectivamente a cada parte del embrión. Después de la inyección, retire el óvulo del estereomicroscopio, corte un trozo de cinta médica de tres centímetros de largo con tijeras pequeñas y conecte la cinta a la abertura.Raspe suavemente la cinta con las tijeras para exprimir las burbujas de aire y luego corte otro trozo de cinta para sellar la abertura en una cruz. Después de sellar la abertura, los embriones inyectados se colocan cuidadosamente de nuevo en la incubadora. Aquí mostramos las imágenes representativas de embriones de pollo post inyección.La primera imagen muestra el resultado de la inyección de plásmido lentivirus. La fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica indica la expresión exitosa del plásmido inyectado en embriones. Esto sugiere la viabilidad de la inyección intravascular de plásmidos en embriones de pollo.La segunda imagen muestra los resultados de la inyección de PGC. Los PGC fueron etiquetados con RFP. En esta imagen pudimos ver los PGC inyectados que son los puntos rojos aquí, ubicados en la gónada de los receptores.Esto indica que los PGC del donante pudieron entrar y colonizar en la gónada de los receptores de manera efectiva. En conclusión, este protocolo presenta el proceso de inyección intravascular in-ovo de materiales exógenos, plásmidos o PGC en embriones de pollo. El método que se muestra aquí es fácil de seguir y aprender y vale la pena la aplicación en muchos campos.Esto es todo lo que me gustaría compartir con ustedes. Espero que este enfoque facilite su trabajo como una poderosa herramienta de investigación en el establecimiento de embriones de pollo y la biología del desarrollo. Gracias por ver este video y buena suerte con su investigación.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

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La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

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Una novela<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banda Técnica para alterar intracardiaca Hemodinámica en un sistema embrionario de pollo

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

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Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

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The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

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Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...