Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

تم دعم المؤلفين بمنحة مؤسسة العلوم الروسية 20-74-00133.

1. وضع العلامات على البروتين الفلورسنت
<ol><li>إعداد المواد<ol>
<li>تحضير 1 M بيكربونات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 9.0، وتخزينها في 4 درجة مئوية، واستخدامها في غضون أسبوع واحد.</li>
		<li>تحضير 1.5 M هيدروكسيلامين هيدروكلوريد العازل، الرقم الهيدروجيني 8.5، مباشرة قبل الاستخدام.</li>
		<li>ت?...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

يمكن تكييف الطريقة المقترحة للتوصيف التقريبي لتفاعل البروتينات مع أغشية الدهون الفوسفاتية من مصادر وتركيبات مختلفة. يعترف قياس التدفق الخلوي الكمي الموصوف هنا برنين البلازمون السطحي (SPR) في العديد من المعلمات. على وجه الخصوص ، لديها حساسية أقل ودقة زمنية وتتطلب وضع علامات الفلورسنت على ا...

تفصل الأغشية الحيوية المحتويات الداخلية للخلايا الحيوانية والفضاء خارج الخلية. لاحظ أن الأغشية تحيط أيضا بالحويصلات الدقيقة التي تشكلت خلال دورة حياة الخلية والعضيات. يتكون غشاء الخلية في الغالب من الدهون والبروتينات. تؤدي البروتينات الغشائية وظائف الإشارات والهيكلية والنقل والمواد اللاصقة. ومع ذلك ، فإن الطبقة الثنائية الدهنية ضرورية أيضا للترابط بين الخلية الحيوانية والفضاء خارج الخلية. تقترح هذه الورقة طريقة لدراسة التفاعل المحيطي للبروتينات الخارجية مع الغشاء الدهني.
المثال الأكثر لفتا للنظر للتفاعلات التي تحدث على طبقة الغشاء الخارجي للخلية الحيوانية هو تفاعل تخثر الدم. من السمات المهمة لتخثر الدم أن جميع التفاعلات الرئيسية تستمر على الأغشية الفوسفاتية للخلايا والحويصلات الدقيقة الناشئة عن هذه الخلايا وليس في البلازما1،2،3. تشمل التفاعلات المعتمدة على الغشاء عملية بدء التخثر (على أغشية الخلايا في البطانة السفلية ، أو البطانة الملتهبة ، أو الخلايا المناعية المنشطة ، بمشاركة عامل أنسجة) ، وجميع تفاعلات التنشيط المتتالي الرئيسي للعوامل التاسع والعاشر والبروثرومبين. تنشيط العامل الحادي عشر عن طريق الثرومبين (على أغشية الصفائح الدموية المنشطة ، كريات الدم الحمراء ، البروتينات الدهنية ، والحويصلات الدقيقة) ؛ ردود فعل مسار البروتين C ؛ تعطيل إنزيمات التخثر (على أغشية الخلايا البطانية بمشاركة العوامل المساعدة للثرومبومودولين ، مستقبلات البروتين البطاني C ، كبريتات الهيباران) ؛ وتفاعلات مسار الاتصال (على أغشية الصفائح الدموية وبعض الحويصلات الدقيقة بمشاركة عوامل مساعدة غير معروفة). وبالتالي ، من المستحيل التحقيق في تخثر الدم دون دراسة تفاعل بروتينات البلازما المختلفة مع غشاء خلايا الدم.
تصف هذه الورقة طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتوصيف تفاعل البروتينات مع الأغشية الدهنية للخلايا أو الحويصلات الدقيقة. تم اقتراح هذا النهج في البداية لدراسة تفاعل بلازما الدم مع الصفائح الدموية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية. علاوة على ذلك ، تتفاعل معظم البروتينات المدروسة مباشرة مع الدهون الفوسفاتية الغشائية سالبة الشحنة ، خاصة مع فوسفاتيديل سيرين 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بروتينات يتم التفاعل مع الغشاء بوساطة مستقبلات خاصة6.
تتمثل إحدى القدرات المهمة لقياس التدفق الخلوي في التمييز بين الأربطة الحرة والمربوطة دون فصل إضافي. تسمح هذه الميزة في قياس الخلايا بدراسة ربط توازن الرباط عند نقطة النهاية وتساعد على إجراء قياسات حركية مستمرة. هذه التقنية غير متطورة ولا تتطلب إعداد عينة معقدة. يستخدم قياس التدفق الخلوي بنشاط لدراسة ديناميات التفاعل بين الببتيدات الفلورية والمستقبلات وبروتينات G في العدلات السليمة والقابلة للنفاذ إلى المنظفات7. هذا النهج قابل للتطبيق أيضا لاستكشاف التفاعلات بين البروتين والحمض النووي وحركية نشاط endonuclease في الوقت الحقيقي8. بمرور الوقت ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين عالية التقارب مع الحويصلات الدهنية النقية9 ، أو بشكل أعم ، مع بروتينات الغشاء المعبر عنها في نظام تعبير خلية Sf9 عالي الكفاءة10. كما تم وصف الطرق الكمية لتوصيف التفاعلات بين البروتين والجسيمات الشحمية باستخدام قياس التدفق الخلوي للبروتينات عبر الغشاء11.
تستخدم هذه التقنية حبات معايرة ذاتية الصنع لتجنب استخدام الخرز المتوفر تجاريا7. كانت خرزات المعايرة المستخدمة سابقا7 تهدف إلى العمل مع الفلوريسين ، مما قيد بشكل كبير مجموعة متنوعة من روابط الفلورسنت التي يمكن الوصول إليها على البروتينات. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة طريقة جديدة للحصول على البيانات الحركية وتحليلها للحصول على دقة زمنية معقولة. على الرغم من وصف هذه الطريقة لحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية ، إلا أنه لا توجد قيود واضحة على قدرتها على التكيف مع الخلايا أو الحويصلات الطبيعية أو الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية ذات تركيبة دهنية مختلفة. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتقدير معلمات التفاعل (kon ، koff) والتوازن (Kd) وتسهل التوصيف الكمي لعدد مواقع ربط البروتين على الغشاء. لاحظ أن هذه التقنية توفر تقديرا تقريبيا لعدد مواقع الربط. مزايا هذه الطريقة هي بساطتها النسبية ، وإمكانية الوصول إليها ، وقدرتها على التكيف مع الخلايا الأصلية والحويصلات الدقيقة الطبيعية والاصطناعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

في جسم الإنسان ، تستمر معظم التفاعلات الفسيولوجية الرئيسية المشاركة في الاستجابة المناعية وتخثر الدم على أغشية الخلايا. الخطوة الأولى المهمة في أي تفاعل يعتمد على الغشاء هي ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية. تم تطوير نهج لدراسة تفاعل البروتين مع الأغشية الدهنية باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية وقياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بدراسة تفاعلات البروتين والأغشية باستخدام الخلايا الحية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الطبيعية أو الاصطناعية. ميزة هذه الطريقة هي بساطة وتوافر الكواشف والمعدات. في هذه الطريقة ، يتم تصنيف البروتينات باستخدام أصباغ الفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن استخدام كل من البروتينات ذاتية الصنع والمتاحة تجاريا ، والتي تحمل علامات الفلورسنت. بعد الاقتران مع صبغة الفلورسنت ، يتم تحضين البروتينات بمصدر للغشاء الفوسفوليبيد (الحويصلات الدقيقة أو الخلايا) ، ويتم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها لحساب الثوابت الحركية والتوازن Kd. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تقدير العدد التقريبي لمواقع ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية باستخدام حبات معايرة خاصة.

تستخدم طريقة قياس التدفق الخلوي الموصوفة هنا لتوصيف ارتباط بروتينات تخثر البلازما بالصفائح الدموية المنشطة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحويصلات الفوسفاتية PS: PC 20: 80 كنظام نموذجي. تركز هذه الورقة بشكل أساسي على الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية كمثال. يجب اختيار معلمات مقياس الخلايا ، على...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

هنا ، نصف مجموعة من الطرق لتوصيف تفاعل البروتينات مع أغشية الخلايا أو الحويصلات الدقيقة.

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

باستخدام طريقة قياس التدفق الخلوي للكمية هذه ، يمكن للباحثين حساب العادات الحركية والتوازن للتفاعل الغشائي الذي يتم إحضاره وتقدير عدد البروتين الذي تجلبه المواقع الموجودة على غشاء PPH. مزايا هذه الطريقة هي بساطة وتوافر الكواشف والمعدات. هذه الطريقة مخصصة حصريا للبحث الأساسي.تم تطوير البروتوكول لدراسة تفاعلات الدهون البروتينية في حساب الدم ، ويمكن استخدامه في مجالات أخرى لتوصيف تفاعل البروتينات مع الأغشية الدهنية المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم كمية ديناميكيات ربط الليغاند على مختلف الخلايا وأنواع الليغاند. ابدأ تجارب الارتباط الحركي عن طريق تخفيف حويصلات الدهون الفوسفاتية في مخزن Tyrode العازل إلى تركيز ميكرومولير واحد وحجم إجمالي قدره 250 ميكرولتر.ثم امزج عامل التخثر الفلورسنت المسمى X أو FX FD وتركيز 500 نانومولير مع حويصلات الدهون الفوسفاتية بنسبة واحد إلى واحد للحصول على حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. حقن على الفور 500 ميكرولتر من التعليق المختلط في مقياس التدفق الخلوي. بمعدل تدفق بطول موجي للإثارة يبلغ 488 نانومتر ومرشح انبعاث يبلغ 585 نانومتر ؛ بعرض 42 للقناة FL الثانية.بعد ذلك ، قم بقياس متوسط التألق في القناة FL Four مع الإثارة عند 633 نانومتر ومرشح الانبعاثات عند 660 نانومتر بعرض 20. عندما يتم تحقيق تشبع الارتباط ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ، وراقب الانفصال حتى يتم الوصول إلى تألق أساسي ، أو هضبة. بالنسبة لتجارب ربط التوازن ، احتضن خمس حويصلات فوسفوليبيد اصطناعية ميكرومولية بتركيزات متفاوتة من FX FD من صفر إلى 1000 نانومولار في مخزن Tyrode المؤقت لمدة 20 دقيقة.بعد الحضانة ، قم بتخفيف كل عينة بمقدار 20 ضعفا إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ثم قم بتحليل العينة المخففة عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 30 ثانية. لتحليل البيانات ، قم بتصدير التجارب بتنسيق FSC من برنامج الحصول على بيانات القياس الخلوي إلى برنامج مقياس الخلايا لتحليل البيانات. عن طريق اختيار الملف ثم النقر فوق علامتي التبويب تصدير وملفات FSC.بمجرد الانتهاء من فتح ملفات FCS في برنامج مقياس الخلايا عن طريق تحديد الملفات الموجودة على الكمبيوتر وسحب الملفات إلى مساحة عمل البرنامج. لبوابة الحويصلات الدقيقة ، حدد منطقة الحويصلات الدقيقة عن طريق التألق في الصبغة المحبة للدهون ، DIC 16 ثلاثة. ثم استخدم زر المؤامرة في ورقة العمل لإنشاء مخطط نقطي SSC من FL two D I C 16 في إحداثيات السجل.ثم اختر زر البوابة المستطيلة لرسم منطقة بوابة. لتحليل التجارب الحركية ، قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام إحداثيات التألق بمرور الوقت لمنطقة الحويصلات. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات المتعلقة بالتغيير في التألق بمرور الوقت بتنسيق CSV ؛ من خلال اختيار العينة والنقر بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب تصدير ، متبوعا باختيار FL أربع مرات في المعلمات ، حدد الدليل للحفظ قبل النقر فوق تحديد تنسيق CSV والضغط على علامة التبويب تصدير.بعد النقل ، افتح ملف CSV في برنامج إحصائي لحساب تألق المتوسط المتحرك البسيط والوقت لكل 1000 حدث تقريبا رسم بياني لاعتماد تألق المتوسط المتحرك الواحد على الوقت تحت افتراض الاعتماد الأسي واستخدام القيمة لحساب ثابت الارتباط الحركي باستخدام معادلة. ثم احسب ثابت التفكك الحركي باستخدام المعادلة كما هو موضح سابقا. لتحليل تاريخ فحص ربط التوازن ، حدد متوسط تألق FX FD في منطقة الحويصلات لكل تركيز محدد من FX FD ثم قم بتقريب اعتماد تألق العامل المرتبط من تركيز العامل المضاف في افتراض ربط موقع واحد.احسب متوسط معلمات الربط باستخدام معادلة من ثلاثة تكرارات مستقلة كحد أدنى. المضي قدما في إعداد الخرز معايرة عن طريق احتضان هلام الصفائح الدموية المصفاة مع الكالسيوم IANA 4A ثلاثة وعشرين ، مائة وسبعة وثمانين في وجود 2.5 ملليمولار كلوريد الكالسيوم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. هل تضيف الصفائح الدموية المنشطة تركيزات مختلفة من FX FD وتحتضن الصفائح الدموية بحجمين من الفورمالديهايد.بعد ساعة واحدة ، أوقف التفاعل عن طريق احتضان الصفائح الدموية بثلاثة جليسين مولي و 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتنقية الخليط من الصبغة غير المتفاعلة مع الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السوبرنات قبل إعادة تعليق الكريات في مخزن Tyrode العازل الذي يحتوي على 0.5٪ BSA.بعد ذلك ، قم بقياس مستوى التألق لخرز المعايرة في كل عينة باستخدام مقياس الطيف الفلوري ثم باستخدام مقياس التدفق الخلوي. حدد عدد الخرز في كل عينة بمساعدة عداد الخلايا. قم بتحويل شدة التألق لكل عينة خرزة إلى تركيز صبغة الفلورسنت القابلة للذوبان باستخدام مقياس الطيف الفلوري وإعادة حساب تركيز صبغة الفلورسنت لعدد جزيئات مقياس الطيف الفلوري.قم بإنشاء رسم بياني للاعتماد على متوسط تألق الخرز في مقياس التدفق الخلوي على عدد جزيئات الفلوروفور لكل عينة. ثم قم بتقريب الاعتماد حسب تناسب الخط باستخدام التحليل المناسب والمناسب لعلامات التبويب الخطية بالترتيب. من التقريب في المعادلة ، احسب عامل التحويل لمتوسط التألق إلى مواقع الربط.في وقت لاحق حساب العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية. يظهر التحليل التمثيلي بوابة حويصلات الدهون الفوسفورية الاصطناعية التي يبلغ حجمها ميكرومتر واحد مع صبغة الفلورسنت المحبة للدهون المدمجة ، الصبغة I C 16 ، تم تعيين البوابة بناء على عينة تحتوي على نفس الحجم حويصلات الدهون الاصطناعية بدون صبغة الفلورسنت. تم تحليل حركية ارتباط البروتين بالحويصلات في المرحلة الأولى عن طريق جمع العينة بشكل مستمر.تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام قياس التدفق الخلوي. يجب أن تبدأ قياسات التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن بعد خلط المحاليل وتخفيفها مع مخزن Tyrode المؤقت. يمكن استكمال الطريقة المقترحة بالرنين البلازمي السطحي لدراسة التفاعلات الغشائية التي تكون حساسة للغاية مع دقة مؤقتة جيدة ولا تتطلب إحضارها في التسليم الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي إمكانية الوصول إليها وبساطتها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

التقييم السريع لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...