Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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作者得到了俄罗斯科学基金会拨款20-74-00133的支持。

1. 荧光蛋白标记
<ol><li>材料准备<ol>
<li>准备1M碳酸氢钠缓冲液，pH 9.0，将其储存在4°C，并在一周内使用。</li>
		<li>使用前立即制备1.5M盐酸羟胺缓冲液，pH 8.5。</li>
		<li>在二甲基亚砜中制备10mg / mL荧光染料溶液（见 材料表）。 注意：该溶液可以在-20°C的黑暗中储存一个月。</li>
		<li>以1-10mg / mL制备纯化的抗体或其他蛋白质的溶液。 注意：避免使用含有铵离子或伯胺?...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

所提出的方法可以适用于蛋白质与来自各种来源和组合物的磷脂膜相互作用的粗略表征。这里描述的定量流式细胞术在几个参数上承认表面等离子体共振（SPR）。特别是，它具有较低的灵敏度和时间分辨率，并且需要蛋白质的荧光标记。荧光标记可导致许多蛋白质的构象变化和活性损失，因此需要仔细控制。但是，这种技术比其他技术具有显着的优势。这种方法提供了探索蛋白质与天然细胞膜相?...

生物膜将动物细胞的内部内容物和细胞外空间分开。请注意，膜也围绕着细胞生命周期和细胞器期间形成的微囊泡。细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。膜蛋白执行信号传导、结构、转运和粘合功能。然而，脂质双层对于动物细胞与细胞外空间的相互关系也是必不可少的。本文提出了一种研究外周蛋白与脂质膜外周相互作用的方法。
在动物细胞的外膜层上发生反应的最引人注目的例子是血液凝固反应。血液凝固的一个重要特征是，所有主要反应都发生在细胞的磷脂膜和从这些细胞产生的微囊泡上，而不是在血浆1，2，3中。膜依赖性反应包括开始凝固的过程（在内皮下，发炎的内皮细胞或活化的免疫细胞的细胞膜上，在组织因子的参与下），主要级联激活因子IX，X，凝血酶原的所有反应;凝血酶激活因子XI（在活化的血小板，红细胞，脂蛋白和微囊泡的膜上）;蛋白C途径的反应;凝血酶失活（在内皮细胞膜上，血栓调节素辅因子，内皮蛋白C受体，硫酸乙酰肝素的参与）;和接触途径反应（在未知辅助因子的参与下的血小板膜和一些微囊泡上）。因此，如果不研究各种血浆蛋白与血细胞膜的相互作用，就不可能研究血液凝固。
本文描述了一种基于流式细胞术的方法，用于表征蛋白质与细胞或微囊泡脂质膜的相互作用。最初提出这种方法是为了研究血浆与血小板和人造磷脂囊泡的相互作用。此外，大多数研究的蛋白质直接与带负电荷的膜磷脂相互作用，特别是与磷脂酰丝氨酸4，5相互作用。此外，有些蛋白质与膜的相互作用是由特殊受体介导的6。
流式细胞术的一项重要能力是区分游离配体和结合配体，而无需额外分离。细胞术的这一特点允许研究终点处的配体平衡结合，并有助于进行连续的动力学测量。该技术并不复杂，不需要复杂的样品制备。流式细胞术被积极用于定量研究完整和洗涤剂渗透性中性粒细胞中荧光肽，受体和G蛋白之间相互作用的动力学7。该方法也适用于实时探索蛋白质 - DNA相互作用和内切酶活性的动力学8。随着时间的推移，该方法用于定量研究高亲和力蛋白与纯化的脂质囊泡9的相互作用，或者更一般地说，与在高效Sf9细胞表达系统10中表达的膜蛋白相互作用。还描述了使用流式细胞术表征跨膜蛋白11的蛋白质 - 脂质体相互作用的定量方法。
该技术使用自制的校准磁珠，以避免使用市售磁珠7。先前使用的校准微球7 旨在与荧光素一起工作，这大大限制了蛋白质上可接触的荧光配体的分类。此外，本文还提供了一种获取和分析动力学数据的新方法，以实现合理的时间分辨率。尽管该方法被描述为用于人造磷脂囊泡，但其对具有不同脂质组合物的细胞，天然囊泡或人造磷脂囊泡的适应性没有明显的限制。本文描述的方法允许估计相互作用（kon，koff）和平衡（Kd）的参数，并有助于定量表征膜上蛋白质结合位点的数量。请注意，该技术提供了结合位点数量的近似估计值。该方法的优点是其相对简单，可及性以及对天然和人造微泡的适应性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

在人体内，大多数涉及免疫反应和血液凝固的主要生理反应都发生在细胞膜上。在任何膜依赖性反应中，重要的第一步是蛋白质在磷脂膜上的结合。已经开发了一种研究蛋白质与脂质膜相互作用的方法，该方法使用荧光标记的蛋白质和流式细胞术。该方法允许使用活细胞和天然或人造磷脂囊泡研究蛋白质 - 膜相互作用。这种方法的优点是试剂和设备的简单性和可用性。在这种方法中，使用荧光染料标记蛋白质。然而，无论是自制的还是市售的荧光标记蛋白都可以使用。与荧光染料偶联后，将蛋白质与磷脂膜源（微泡或细胞）孵育，并通过流式细胞术分析样品。获得的数据可用于计算动力学常数和平衡Kd。此外，可以使用特殊的校准珠来估计磷脂膜上蛋白质结合位点的近似数量。

本文描述的流式细胞术方法用于表征血浆凝固蛋白与活化血小板的结合。此外，还应用磷脂囊泡PS：PC 20：80作为模型系统。本文主要以人工磷脂囊泡为例。必须为每个特定设备，研究对象（细胞，人造或天然微囊泡）和使用的染料选择细胞仪的参数，特别是光电倍增管（PMT）电压和补偿。 图1B，C 显示了用掺入的亲脂性荧光染料DiIC16（3）浇口〜1μm大小的人造磷?...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

在这里，我们描述了一组表征蛋白质与细胞膜或微囊泡相互作用的方法。

使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微泡的相互作用

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

使用这种数量流式细胞术方法，研究人员可以计算引入膜相互作用的动力学和平衡习惯，并估计PPH膜上位点引入的蛋白质数量。这种方法的优点是试剂和设备的简单性和可用性。这种方法专门用于基础研究。该协议旨在研究血液计算中的蛋白质脂质相互作用，并可用于其他领域来表征蛋白质与各种脂质膜的相互作用。该方法可用于评估配体结合动力学对各种细胞和配体类型的影响。通过将Tyrode缓冲液中的磷脂囊泡稀释至一微摩尔的浓度和250微升的总体积来开始动力学结合实验。然后将荧光标记的凝血因子X或FX FD和浓度为500纳摩尔的磷脂囊泡以一比一的比例混合，得到总体积为500微升。立即将500微升的混合悬浮液注入流式细胞仪中。在激发波长为488纳米的流速和585纳米的发射滤光片下，通道FL 2的宽度为42。接下来测量通道FL 4中的平均荧光，激发波长为633纳米，发射滤光片为660纳米，宽度为20。当达到结合饱和度时，用Tyrode缓冲液快速稀释样品20倍，并监测解离，直到达到基线荧光或平台。对于平衡结合实验，在Tyrode的缓冲液中孵育五个微摩尔人造磷脂囊泡，其FX FD浓度从0到1000纳摩尔不等，持续20分钟。孵育后，用Tyrode缓冲液将每个样品稀释20倍至200微升的最终体积，然后在30秒内通过流式细胞术分析稀释的样品。要分析数据，请将FSC格式的实验从细胞仪数据采集软件导出到细胞仪软件进行数据分析。通过选择文件，然后单击导出和 FSC 文件选项卡。完成后，通过选择计算机上的文件并将文件拖到程序的工作空间中，将FCS文件打开到细胞仪软件中。对于微囊泡的门控，通过亲脂性染料的荧光识别微泡的区域，DIC 16三。然后使用工作表中的绘图按钮从对数坐标中的FL两个D I C 16创建点图SSC。然后选择矩形门按钮以绘制浇口区域。为了分析动力学实验，使用囊泡区域随时间变化的荧光坐标创建点图。接下来，以CSV格式导出荧光随时间变化的数据;通过选择样品并右键单击导出选项卡，然后选择FL四次参数，选择要保存的目录，然后单击选择CSV格式并点击导出选项卡。转移后，在统计软件中打开CSV文件，计算每1000个事件的简单移动平均荧光和时间近似于指数依赖性假设下单个移动平均荧光对时间的依赖性图，并使用该值使用方程计算动能关联常数。然后使用前面描述的方程计算动能解离常数。为了分析平衡结合测定的日期，确定FX FD在囊泡区域中对于每个选定浓度的FX FD的平均荧光，然后在假设单位点结合时从添加因子的浓度近似结合因子荧光的依赖性。至少使用三个独立重复的方程式计算平均结合参数。通过在室温下在2.5毫摩尔氯化钙存在下，将凝胶过滤的IANA 4A血小板孵育23、1807，以制备校准的磁珠。活化的血小板是否加入各种浓度的FX FD，并用2体积百分比的甲醛孵育血小板。一小时后，通过在室温下用三摩尔甘氨酸和5%BSA孵育血小板30分钟来停止反应。然后从未反应的染料中纯化混合物，以400倍G离心5分钟。在将颗粒重悬于含有0.5%BSA的Tyrode缓冲液中之前，除去上过氧化物。接下来，使用分光荧光计测量每个样品中校准微球的荧光水平，然后使用流式细胞仪。在细胞计数器的帮助下确定每个样品中的磁珠数量。使用分光荧光计将每个相应磁珠样品的荧光强度转换为可溶性荧光染料的浓度，并重新计算分光荧光计分子数的荧光染料浓度。创建流式细胞仪中微球平均荧光对每个样品的荧光团分子数量的依赖图。然后使用分析拟合和拟合线性选项卡按顺序按线比例近似依赖关系。根据等式中的近似值，计算平均荧光到结合位点的转换因子。然后计算每个感兴趣囊泡的结合位点的表观数量。代表性分析显示，将装有亲脂性荧光染料I C 16的尺寸为一微米的人工磷脂质囊泡的门控，该门基于含有相同尺寸的人工脂质囊泡的样品设置，而没有荧光染料。通过连续收集样品，在第一阶段分析蛋白质与囊泡结合的动力学。使用流式细胞术分析获得的数据。流式细胞术测量应在混合溶液并用Tyrode缓冲液稀释后尽快开始。该方法可辅以表面等离子体共振，用于研究膜相互作用，其高度敏感，具有良好的临时分辨率，不需要引入递送。

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