Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne blev støttet af et russisk videnskabsfondstilskud 20-74-00133.

1. Fluorescerende protein mærkning
<ol><li>Materiale forberedelse<ol>
<li>Forbered 1 M natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0, opbevar den ved 4 °C, og brug den inden for en uge.</li>
		<li>Der fremstilles 1,5 M hydroxylaminhydrochloridbuffer, pH 8,5, umiddelbart før brug.</li>
		<li>Der fremstilles en 10 mg/ml opløsning af fluorescerende farvestof (se materialetabellen) i dimethylsulfoxid. BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares i en måned ved -20 °C i mørke.</li>
		<li>Der fremsti...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

Den foreslåede metode kan tilpasses til en grov karakterisering af interaktionen mellem proteiner og fosfolipidmembraner fra forskellige kilder og sammensætninger. Den kvantitative flowcytometri, der er beskrevet her, indrømmer overfladeplasmonresonans (SPR) i flere parametre. Det har især en lavere følsomhed og tidsopløsning og kræver fluorescerende mærkning af proteiner. Fluorescerende mærkning kan føre til en ændring i konformation og tab af aktivitet for mange proteiner og kræver derfor omhyggelig kontrol...

Biomembraner adskiller det indre indhold af dyreceller og ekstracellulært rum. Bemærk, at membraner også omgiver mikrovesikler dannet under cellens livscyklus og organeller. Cellemembranen består overvejende af lipider og proteiner. Membranproteiner udfører signal-, struktur-, transport- og klæbefunktioner. Lipiddobbeltlaget er imidlertid også afgørende for sammenhængen mellem dyrecellen og det ekstracellulære rum. Dette papir foreslår en metode til undersøgelse af den perifere interaktion mellem eksterne proteiner og lipidmembranen.
Det mest slående eksempel på reaktioner, der forekommer på det ydre membranlag af en dyrecelle, er blodkoagulationsreaktionen. Et vigtigt træk ved blodkoagulation er, at alle hovedreaktioner fortsætter på fosfolipidmembranerne i celler og mikrovesikler, der stammer fra disse celler og ikke i plasma 1,2,3. Membranafhængige reaktioner indbefatter processen med at starte koagulation (på cellemembranerne i subendotelet, betændt endotel eller aktiverede immunceller med deltagelse af en vævsfaktor), alle reaktioner af hovedkaskadeaktivering af faktorer IX, X, protrombin; aktivering af faktor XI med thrombin (på membranerne i aktiverede blodplader, erythrocytter, lipoproteiner og mikrovesikler); reaktioner af protein C-vejen; inaktivering af koagulationsenzymer (på membranerne i endotelceller med deltagelse af trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-receptor, heparansulfat); og kontaktvejsreaktioner (på membraner af blodplader og nogle mikrovesikler med deltagelse af ukendte cofaktorer). Det er således umuligt at undersøge blodkoagulation uden at studere interaktionen mellem forskellige plasmaproteiner og blodcellernes membran.
Dette papir beskriver en flow-cytometribaseret metode til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og lipidmembraner i celler eller mikrovesikler. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt foreslået for at studere interaktionen mellem blodplasma og blodplader og kunstige fosfolipidvesikler. Desuden interagerer de fleste af de undersøgte proteiner direkte med negativt ladede membranphospholipider, især med phosphatidylserin 4,5. Derudover er der proteiner, hvis interaktion med membranen medieres af specielle receptorer6.
En vigtig evne til flowcytometri er at skelne mellem frie og bundne ligander uden yderligere adskillelse. Denne funktion af cytometri tillader undersøgelse af ligandligevægtbinding ved slutpunktet og hjælper med at udføre kontinuerlige kinetiske målinger. Teknikken er usofistikeret og kræver ikke kompleks prøveforberedelse. Flowcytometri bruges aktivt til kvantitativt at studere dynamikken i interaktion mellem fluorescerende peptider, receptorer og G-proteiner i intakte og vaskemiddelgennemtrængelige neutrofiler7. Denne tilgang kan også anvendes til udforskning af protein-DNA-interaktioner og kinetikken af endonukleaseaktivitet i realtid8. Over tid blev denne metode brugt til kvantitativt at studere protein-proteininteraktioner med høj affinitet med oprensede lipidvesikler9 eller mere generelt med membranproteiner udtrykt i et meget effektivt Sf9-celleekspressionssystem10. Kvantitative metoder er også blevet beskrevet til karakterisering af protein-liposominteraktioner ved anvendelse af flowcytometri til transmembranproteiner11.
Denne teknik bruger selvfremstillede kalibreringsperler for at undgå at bruge kommercielt tilgængelige perler7. Kalibreringsperlerne, der blev brugt tidligere7 , var beregnet til at arbejde med fluorescein, hvilket væsentligt begrænsede sortimentet af tilgængelige fluorescerende ligander på proteinerne. Derudover tilbyder dette papir en ny måde at erhverve og analysere kinetiske data til rimelig tidsopløsning. Selvom denne metode er beskrevet for kunstige fosfolipidvesikler, er der ingen åbenlyse begrænsninger for dens tilpasningsevne til celler, naturlige vesikler eller kunstige fosfolipidvesikler med en anden lipidsammensætning. Metoden beskrevet heri tillader estimering af parametrene for interaktion (kon, koff) og ligevægt (Kd) og letter kvantitativ karakterisering af antallet af proteinbindingssteder på membranen. Bemærk, at denne teknik giver et omtrentligt skøn over antallet af bindingssteder. Fordelene ved metoden er dens relative enkelhed, tilgængelighed og tilpasningsevne til indfødte celler og naturlige og kunstige mikrovesikler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

I menneskekroppen fortsætter de fleste af de vigtigste fysiologiske reaktioner, der er involveret i immunresponset og blodkoagulationen, på cellernes membraner. Et vigtigt første skridt i enhver membranafhængig reaktion er binding af protein på fosfolipidmembranen. En tilgang til at studere proteininteraktion med lipidmembraner er udviklet ved hjælp af fluorescerende mærkede proteiner og flowcytometri. Denne metode tillader undersøgelse af protein-membran interaktioner ved anvendelse af levende celler og naturlige eller kunstige phospholipid vesikler. Fordelen ved denne metode er enkelheden og tilgængeligheden af reagenser og udstyr. I denne metode mærkes proteiner ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Imidlertid kan både selvfremstillede og kommercielt tilgængelige, fluorescerende mærkede proteiner anvendes. Efter konjugering med et fluorescerende farvestof inkuberes proteinerne med en kilde til phospholipidmembranen (mikrovesikler eller celler), og prøverne analyseres ved flowcytometri. De opnåede data kan bruges til at beregne de kinetiske konstanter og ligevægt Kd. Derudover er det muligt at estimere det omtrentlige antal proteinbindingssteder på fosfolipidmembranen ved hjælp af specielle kalibreringsperler.

Flowcytometrimetoden beskrevet heri anvendes til at karakterisere bindingen af plasmakoagulationsproteiner til aktiverede blodplader. Derudover blev fosfolipidvesikler PS:PC 20:80 anvendt som et modelsystem. Dette papir fokuserer primært på kunstige fosfolipidvesikler som et eksempel. Parametrene for cytometeret, især fotomultiplierrørets (PMT) spænding og kompensationen, skal vælges for hver specifik enhed, genstanden for undersøgelsen (celler, kunstige eller naturlige mikrovesikler) og de anvendte farvestoffer. ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Her beskriver vi et sæt metoder til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og membraner af celler eller mikrovesikler.

Analyse af interaktionen mellem fluorescerende mærkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjælp af kvantitativ flowcytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Ved hjælp af denne mængde flow cytometri metode kan forskere beregne kinetisk og ligevægtsskik for bragt i membraninteraktion og estimere antallet af protein bragt ind af steder på PPH-membranen. Fordelene ved denne metode er enkelheden og tilgængeligheden af reagenser og udstyr. Denne metode er udelukkende til grundforskning.Protokollen blev udviklet til at studere proteinlipidinteraktioner i blodberegning og kan bruges på andre områder til at karakterisere interaktionen mellem proteiner og forskellige lipidmembraner. Metoden kan anvendes til mængdevurdering af ligandbindingsdynamikken på de forskellige celler og ligandtyper. Start de kinetiske bindingsforsøg ved at fortynde fosfolipidvesikler i Tyrodes buffer til en koncentration på en mikromolar og et samlet volumen på 250 mikroliter.Bland derefter fluorescerende mærket koagulationsfaktor X eller FX FD og en koncentration på 500 nanomolar med fosfolipidvesikler i et en til et forhold for at få et samlet volumen på 500 mikroliter. Injicer straks 500 mikroliter af den blandede suspension i flowcytometeret. Ved en strømningshastighed med en excitationsbølgelængde på 488 nanometer og et emissionsfilter på 585 nanometer;med en bredde på 42 for kanal FL to.Mål derefter den gennemsnitlige fluorescens i kanal FL fire med excitation ved 633 nanometer og emissionsfilter ved 660 nanometer med en bredde på 20. Når bindingsmætningen opnås hurtigt, fortyndes prøven 20 gange med Tyrodes buffer, og dissociationen overvåges, indtil en baseline fluorescens eller et plateau er nået. Til ligevægtsbindingsforsøg inkuberes fem mikromolære kunstige fosfolipidvesikler med varierende koncentrationer af FX FD fra nul til 1000 nanomolar i Tyrodes buffer i 20 minutter.Efter inkubation fortyndes hver prøve med 20 gange til et endeligt volumen på 200 mikroliter med Tyrodes buffer, og den fortyndede prøve analyseres derefter ved flowcytometri inden for 30 sekunder. For at analysere dataene skal du eksportere eksperimenterne i FSC-format fra cytometridataopsamlingssoftware til cytometersoftware til dataanalyse. Ved at vælge filen og derefter klikke på fanerne Eksportér og FSC-filer.når du er færdig, skal du åbne FCS-filerne i cytometersoftwaren ved at vælge filerne på computeren og trække filerne til programmets arbejdsområde. Til gating af mikrovesiklerne skal du identificere regionen af mikrovesikler ved fluorescens af det lipofile farvestof, DIC 16 tre. Brug derefter plotknappen i regnearket til at oprette et prikdiagram SSC fra FL to D I C 16 i logkoordinater.Vælg derefter den rektangulære portknap for at tegne et gatingområde. For at analysere de kinetiske eksperimenter oprettes et prikplot ved hjælp af fluorescenskoordinaterne over tiden for vesiklernes region. Eksporter derefter dataene om ændringen i fluorescens over tid i CSV-formatet;ved at vælge prøve og højreklikke på eksportfanen, efterfulgt af at vælge FL fire gange i parametre, vælg mappe til lagring, før du klikker på det valgte CSV-format og trykker på eksportfanen.Efter overførsel skal du åbne CSV-filen i statistisk software for at beregne den enkle glidende gennemsnitlige fluorescens og tid for hver 1000 begivenheder tilnærme en graf over afhængigheden af den enkelte glidende gennemsnitlige fluorescens til tiden under antagelse af eksponentiel afhængighed og bruge værdien til at beregne den kinetiske associeringskonstant ved hjælp af en ligning. Beregn derefter den kinetiske dissociationskonstant ved hjælp af ligningen som beskrevet tidligere. For at analysere datoen for ligevægtsbindingsassayet bestemmes den gennemsnitlige fluorescens af FX FD i vesiklerområdet for hver valgt koncentration af FX FD og derefter tilnærme afhængigheden af den bundne faktor fluorescens fra koncentrationen af den tilsatte faktor i antagelsen om enkeltstedsbinding.Beregn de gennemsnitlige bindingsparametre ved hjælp af en ligning fra mindst tre uafhængige gentagelser. Fortsæt med at forberede kalibrerede perler ved at inkubere gelfiltrerede blodplader med calcium IANA 4A treogtyve, hundrede og syvogfirs i nærværelse af 2,5 millimolar calciumchlorid i 10 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt de aktiverede blodplader de forskellige koncentrationer af FX FD og inkuberer blodpladerne med to volumenprocent formaldehyd.Efter en time skal du stoppe reaktionen ved at inkubere blodpladerne med tre molært glycin og 5% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter renses blandingen fra det ureagerede farvestof med centrifugering ved 400 gange G i fem minutter. Fjern supernatet, før pelleten sættes tilbage i Tyrodes buffer indeholdende 0,5% BSA.Derefter måles fluorescensniveauet for kalibreringsperlerne i hver prøve ved hjælp af et spektrofluorometer og derefter ved hjælp af flowcytometeret. Bestem antallet af perler i hver prøve ved hjælp af en celletæller. Fluorescensintensiteten af hver respektive perleprøve konverteres til koncentrationen af opløseligt fluorescerende farvestof ved hjælp af et spektrofluorometer, og den fluorescerende farvestofkoncentration genberegnes for antallet af spektrofluorometermolekyler.Opret en afhængighedsgraf for den gennemsnitlige fluorescens af perlerne i et flowcytometer på antallet af fluroformolekyler for hver prøve. Tilnærm derefter afhængigheden efter linjeproportionalitet ved hjælp af analysetilpasningen og tilpas lineære faner i rækkefølge. Ud fra tilnærmelsen i ligningen beregnes omregningsfaktoren for den gennemsnitlige fluorescens til bindingssteder.Beregn senere det tilsyneladende antal bindingssteder pr. Vesikel af interesse. Den repræsentative analyse viser gating af de kunstige fosforlipidvesikler, der er en mikrometer i størrelse med det inkorporerede lipofile fluorescerende farvestof, farvestof I C 16, porten blev indstillet baseret på en prøve indeholdende samme størrelse kunstige lipidvesikler uden det fluorescerende farvestof. Kinetikken af proteinbindingen til vesiklerne blev analyseret i første fase ved at indsamle prøven kontinuerligt.De opnåede data blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Flowcytometriske målinger bør påbegyndes så hurtigt som muligt efter blanding af opløsningerne og fortynding med Tyrodes buffer. Den foreslåede metode kunne suppleres med overfladeplasmaresonans til undersøgelse af bragt membraninteraktioner, som er meget følsomme med god midlertidig opløsning og ikke kræver bragt i levering Den største fordel ved denne metode er dens tilgængelighed og enkelhed.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Efterligning af funktion signalproteiner: Mod Artificial Signal transduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Papirbaseret forkoncentration og isolering af mikrovekler og exosoler

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Hurtig vurdering af membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...