Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

De auteurs werden ondersteund door een subsidie van de Russian Science Foundation 20-74-00133.

1. Fluorescerende eiwitetikettering
<ol><li>Materiaalvoorbereiding<ol>
<li>Bereid 1 M natriumbicarbonaatbuffer, pH 9,0, bewaar het bij 4 °C en gebruik het binnen een week.</li>
		<li>Bereid 1,5 M hydroxylaminehydrochloridebuffer, pH 8,5, onmiddellijk voor gebruik.</li>
		<li>Bereid een 10 mg/ml oplossing van fluorescerende kleurstof (zie de tabel met materialen) in dimethylsulfoxide. OPMERKING: Deze oplossing kan een maand worden bewaard bij -20 °C in het donker.</li>
		<li>Bereid...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

De voorgestelde methode kan worden aangepast voor een ruwe karakterisering van de interactie van eiwitten met fosfolipidemembranen uit verschillende bronnen en samenstellingen. De hier beschreven kwantitatieve flowcytometrie geeft toe aan oppervlakteplasmonresonantie (SPR) in verschillende parameters. In het bijzonder heeft het een lagere gevoeligheid en tijdresolutie en vereist het fluorescerende etikettering van eiwitten. Fluorescerende etikettering kan leiden tot een verandering in conformatie en verlies van activitei...

Biomembranen scheiden de inwendige inhoud van dierlijke cellen en extracellulaire ruimte. Merk op dat membranen ook microvesicles omringen die zijn gevormd tijdens de levenscyclus van de cel en organellen. Het celmembraan bestaat voornamelijk uit lipiden en eiwitten. Membraaneiwitten voeren signaal-, structurele, transport- en kleeffuncties uit. De lipide bilayer is echter ook essentieel voor de onderlinge relatie van de dierlijke cel met de extracellulaire ruimte. Dit artikel stelt een methode voor om de perifere interactie van externe eiwitten met het lipidemembraan te bestuderen.
Het meest treffende voorbeeld van reacties op de buitenste membraanlaag van een dierlijke cel is de bloedstollingsreactie. Een belangrijk kenmerk van bloedstolling is dat alle hoofdreacties plaatsvinden op de fosfolipidemembranen van cellen en microvesicles die uit deze cellen voortkomen en niet in het plasma 1,2,3. Membraanafhankelijke reacties omvatten het proces van het starten van coagulatie (op de celmembranen van het subendotheel, ontstoken endotheel of geactiveerde immuuncellen, met de deelname van een weefselfactor), alle reacties van de belangrijkste cascade-activering van factoren IX, X, protrombine; activering van factor XI door trombine (op de membranen van geactiveerde bloedplaatjes, erytrocyten, lipoproteïnen en microvesicles); reacties van de eiwit C-route; inactivatie van stollingsenzymen (op de membranen van endotheelcellen met de deelname van trombomodulinecofactoren, endotheeleiwit C-receptor, heparansulfaat); en contactwegreacties (op membranen van bloedplaatjes en sommige microvesicles met de deelname van onbekende cofactoren). Het is dus onmogelijk om bloedstolling te onderzoeken zonder de interactie van verschillende plasma-eiwitten met het membraan van bloedcellen te bestuderen.
Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met lipidemembranen van cellen of microvesicles. Deze aanpak werd aanvankelijk voorgesteld om de interactie van bloedplasma met bloedplaatjes en kunstmatige fosfolipideblaasjes te bestuderen. Bovendien interageren de meeste van de bestudeerde eiwitten direct met negatief geladen membraanfosfolipiden, met name met fosfatidylserine 4,5. Bovendien zijn er eiwitten waarvan de interactie met het membraan wordt gemedieerd door speciale receptoren6.
Een belangrijk vermogen van flowcytometrie is het onderscheiden van vrije en gebonden liganden zonder extra scheiding. Dit kenmerk van cytometrie maakt de studie van ligand-evenwichtsbinding op het eindpunt mogelijk en helpt bij het uitvoeren van continue kinetische metingen. De techniek is ongekunsteld en vereist geen complexe monstervoorbereiding. Flowcytometrie wordt actief gebruikt om de dynamiek van de interactie tussen fluorescerende peptiden, receptoren en G-eiwitten in intacte en detergent-permeabele neutrofielen kwantitatief te bestuderen7. Deze benadering is ook van toepassing voor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties en de kinetiek van endonuclease-activiteit in realtime8. In de loop van de tijd werd deze methode gebruikt om eiwit-eiwitinteracties met hoge affiniteit kwantitatief te bestuderen met gezuiverde lipideblaasjes9, of, meer in het algemeen, met membraaneiwitten uitgedrukt in een zeer efficiënt Sf9-celexpressiesysteem10. Kwantitatieve methoden zijn ook beschreven voor het karakteriseren van eiwit-liposoom interacties met behulp van flowcytometrie voor transmembraaneiwitten11.
Deze techniek maakt gebruik van zelfgemaakte kalibratieparels om te voorkomen dat in de handel verkrijgbare kralen wordengebruikt 7. De eerder gebruikte kalibratieparels7 waren bedoeld om te werken met fluoresceïne, wat het assortiment toegankelijke fluorescerende liganden op de eiwitten aanzienlijk beperkte. Bovendien biedt dit artikel een nieuwe manier om kinetische gegevens te verkrijgen en te analyseren voor een redelijke tijdsresolutie. Hoewel deze methode wordt beschreven voor kunstmatige fosfolipide blaasjes, zijn er geen duidelijke beperkingen voor het aanpassingsvermogen aan cellen, natuurlijke blaasjes of kunstmatige fosfolipide blaasjes met een andere lipidesamenstelling. De hierin beschreven methode maakt het mogelijk de parameters van interactie (kaan, kuit) en evenwicht (Kd) te schatten en vergemakkelijkt de kwantitatieve karakterisering van het aantal eiwitbindingsplaatsen op het membraan. Merk op dat deze techniek een geschatte schatting geeft van het aantal bindingsplaatsen. De voordelen van de methode zijn de relatieve eenvoud, toegankelijkheid en aanpasbaarheid aan inheemse cellen en natuurlijke en kunstmatige microvesicles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

In het menselijk lichaam vinden de meeste van de belangrijkste fysiologische reacties die betrokken zijn bij de immuunrespons en bloedstolling plaats op de membranen van cellen. Een belangrijke eerste stap in elke membraanafhankelijke reactie is binding van eiwit op het fosfolipidemembraan. Een benadering voor het bestuderen van eiwitinteractie met lipidembranen is ontwikkeld met behulp van fluorescerend gelabelde eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt de studie van eiwit-membraaninteracties mogelijk met behulp van levende cellen en natuurlijke of kunstmatige fosfolipide blaasjes. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Bij deze methode worden eiwitten gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Er kunnen echter zowel zelfgemaakte als commercieel verkrijgbare, fluorescerend gelabelde eiwitten worden gebruikt. Na conjugatie met een fluorescerende kleurstof worden de eiwitten geïncubeerd met een bron van het fosfolipidemembraan (microvesicles of cellen) en worden de monsters geanalyseerd door flowcytometrie. De verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om de kinetische constanten en het evenwicht Kd te berekenen. Bovendien is het mogelijk om het geschatte aantal eiwitbindingsplaatsen op het fosfolipidemembraan te schatten met behulp van speciale kalibratieparels.

De hierin beschreven flowcytometriemethode wordt gebruikt om de binding van plasmastollingseiwitten aan geactiveerde bloedplaatjes te karakteriseren. Daarnaast werden fosfolipide blaasjes PS:PC 20:80 toegepast als modelsysteem. Dit artikel richt zich vooral op kunstmatige fosfolipide blaasjes als voorbeeld. De parameters van de cytometer, met name de spanning van de fotomultiplicatorbuis (PMT) en de compensatie moeten worden geselecteerd voor elk specifiek hulpmiddel, het onderzoeksobject (cellen, kunstmatige of natuurli...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.

Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Met behulp van deze hoeveelheidsstroomcytometriemethode kunnen onderzoekers de kinetische en evenwichtsgebruiken van ingebrachte membraaninteractie berekenen en het aantal eiwitten schatten dat wordt binnengebracht door locaties op het PPH-membraan. De voordelen van deze methode zijn de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Deze methode is uitsluitend bedoeld voor fundamenteel onderzoek.Het protocol is ontwikkeld om eiwitlipide-interacties in bloedberekening te bestuderen en kan op andere gebieden worden gebruikt om de interactie van eiwitten met verschillende lipidemembranen te karakteriseren. De methode kan worden gebruikt voor de kwantiteitsbeoordeling van ligandbindingsdynamica op de verschillende cellen en ligandtypen. Start de kinetische bindingsexperimenten door fosfolipide blaasjes in de buffer van Tyrode te verdunnen tot een concentratie van één micromolair en een totaal volume van 250 microliter.Meng vervolgens fluorescerende gelabelde stollingsfactor X of FX FD en een concentratie van 500 nanomolair met de fosfolipide blaasjes in een één-op-één verhouding om een totaal volume van 500 microliter te krijgen. Injecteer onmiddellijk 500 microliter van de gemengde suspensie in de flowcytometer. Bij een stroomsnelheid met een excitatiegolflengte van 488 nanometer en een emissiefilter van 585 nanometer;met een breedte van 42 voor kanaal FL twee.Meet vervolgens de gemiddelde fluorescentie in kanaal FL vier met excitatie op 633 nanometer en emissiefilter op 660 nanometer met een breedte van 20. Wanneer de verzadiging van de binding is bereikt, verdunt het monster snel 20-voudig met de buffer van Tyrode en controleert u de dissociatie totdat een basisvloeiingsfluorescentie of een plateau is bereikt. Voor evenwichtsbindingsexperimenten incubeer vijf micromolaire kunstmatige fosfolipide blaasjes met variërende concentraties FX FD van nul tot 1000 nanomolaar in de buffer van Tyrode gedurende 20 minuten.Verdun na incubatie elk monster met een factor 20 tot een laatste volume van 200 microliter met de buffer van Tyrode en analyseer vervolgens het verdunde monster binnen 30 seconden door flowcytometrie. Om de gegevens te analyseren, exporteert u de experimenten in FSC-formaat van cytometriegegevensacquisitiesoftware naar cytometersoftware voor gegevensanalyse. Door het bestand te kiezen en vervolgens op de tabbladen export- en FSC-bestanden te klikken.als u klaar bent, opent u de FCS-bestanden in cytometersoftware door de bestanden op de computer te selecteren en de bestanden naar de werkruimte van het programma te slepen. Voor het gating van de microvesicles, identificeer het gebied van microvesicles door fluorescentie van de lipofiele kleurstof, DIC 16 drie. Gebruik vervolgens de plotknop in het werkblad om een dot plot SSC te maken van FL twee D I C 16 in logcoördinaten.Kies vervolgens de rechthoekige poortknop om een gatgebied te tekenen. Om de kinetische experimenten te analyseren, maakt u een dot plot met behulp van de coördinaten van fluorescentie over de tijd voor het gebied van de blaasjes. Exporteer vervolgens de gegevens over de verandering in fluorescentie in de loop van de tijd in het CSV-formaat; door een voorbeeld te kiezen en met de rechtermuisknop op het exporttabblad te klikken, gevolgd door fl vier keer in parameters te kiezen, de map te selecteren om op te slaan voordat u op het geselecteerde CSV-formaat klikt en op het tabblad exporteren klikt.Open na overdracht het CSV-bestand in statistische software om de eenvoudige voortschrijdende gemiddelde fluorescentie en tijd voor elke 1000 gebeurtenissen te berekenen, benadert een grafiek van de afhankelijkheid van de enkele voortschrijdende gemiddelde fluorescentie op tijd onder de aanname van exponentiële afhankelijkheid en gebruik de waarde om de kinetische associatieconstante te berekenen met behulp van een vergelijking. Bereken vervolgens de kinetische dissociatieconstante met behulp van de vergelijking zoals eerder beschreven. Om de datum van de evenwichtsbindingstest te analyseren, bepaalt u de gemiddelde fluorescentie van FX FD in het gebied van de blaasjes voor elke geselecteerde concentratie FX FD en benadert u vervolgens de afhankelijkheid van de gebonden factorfluorescentie van de concentratie van de toegevoegde factor in de aanname van binding op één plaats.Bereken de gemiddelde bindingsparameters met behulp van een vergelijking van minimaal drie onafhankelijke herhalingen. Ga verder met het bereiden van gekalibreerde kralen door gel gefilterde bloedplaatjes te incuberen met calcium IANA 4A drieëntwintig, honderdzevenentachtig in aanwezigheid van 2,5 millimolair calciumchloride gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de geactiveerde bloedplaatjes de verschillende concentraties FX FD toe en incubeer de bloedplaatjes met twee volumeprocent formaldehyde.Stop na een uur de reactie door de bloedplaatjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met drie molaire glycine en 5% BSA. Zuiver vervolgens het mengsel van de niet-gereageerde kleurstof met centrifugatie op 400 maal G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernate voordat u de pellet resuspendeert in de buffer van Tyrode met 0,5% BSA.Meet vervolgens het fluorescentieniveau van de kalibratieparels in elk monster met behulp van een spectrofluorometer en vervolgens met behulp van de flowcytometer. Bepaal het aantal kralen in elk monster met behulp van een celteller. Converteer de fluorescentie-intensiteit van elk respectievelijk kraalmonster naar de concentratie oplosbare fluorescerende kleurstof met behulp van een spectrofluorometer en herbereken de fluorescentiekleurstofconcentratie voor het aantal spectrofluorometermoleculen.Maak een afhankelijkheidsgrafiek van de gemiddelde fluorescentie van de kralen in een flowcytometer op het aantal flurofore-moleculen voor elk monster. Benader vervolgens de afhankelijkheid door lijnproportionaliteit met behulp van de analyse die lineaire tabbladen in volgorde past en past. Bereken op basis van de benadering in de vergelijking de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen.Bereken later het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesikel van belang. De representatieve analyse toont gating van de kunstmatige fosforlipideblaasjes die één micrometer groot zijn met de opgenomen lipofiele fluorescerende kleurstof, kleurstof I C 16, de poort werd ingesteld op basis van een monster met dezelfde grootte kunstmatige lipideblaasjes zonder de fluorescerende kleurstof. De kinetiek van het eiwit dat zich aan de blaasjes bindt, werd in de eerste fase geanalyseerd door het monster continu te verzamelen.De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De flowcytometrische metingen moeten zo snel mogelijk beginnen na het mengen van de oplossingen en het verdunnen met de buffer van Tyrode. De voorgestelde methode kan worden aangevuld met oppervlakteplasmaresonantie voor het bestuderen van ingebrachte membraaninteracties die zeer gevoelig zijn met een goede tijdelijke resolutie en geen levering vereisen Het belangrijkste voordeel van deze methode is de toegankelijkheid en eenvoud.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Snelle beoordeling van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...