Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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Les auteurs ont été soutenus par une subvention de la Fondation russe pour la science 20-74-00133.

1. Marquage des protéines fluorescentes
<ol><li>Préparation du matériel<ol>
<li>Préparez 1 M de tampon de bicarbonate de sodium, pH 9,0, conservez-le à 4 °C et utilisez-le dans un délai d’une semaine.</li>
		<li>Préparer un tampon de chlorhydrate d’hydroxylamine de 1,5 M, pH 8,5, immédiatement avant utilisation.</li>
		<li>Préparer une solution de colorant fluorescent à 10 mg/mL (voir la Table des matériaux) dans du sulfure de diméthyle. REMARQUE: Cette solution peu...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

La méthode proposée peut être adaptée pour une caractérisation approximative de l’interaction des protéines avec les membranes phospholipides provenant de diverses sources et compositions. La cytométrie quantitative en flux décrite ici concède à la résonance plasmonique de surface (SPR) dans plusieurs paramètres. En particulier, il a une sensibilité et une résolution temporelle plus faibles et nécessite un marquage fluorescent des protéines. Le marquage fluorescent peut entraîner un changement de confo...

Les biomembranes séparent le contenu interne des cellules animales et de l’espace extracellulaire. Notez que les membranes entourent également les microvésicules formées au cours du cycle de vie de la cellule et les organites. La membrane cellulaire est principalement composée de lipides et de protéines. Les protéines membranaires remplissent des fonctions de signalisation, structurelles, de transport et d’adhésif. Cependant, la bicouche lipidique est également essentielle pour l’interrelation de la cellule animale avec l’espace extracellulaire. Cet article propose une méthode pour étudier l’interaction périphérique des protéines externes avec la membrane lipidique.
L’exemple le plus frappant de réactions se produisant sur la couche membranaire externe d’une cellule animale est la réaction de coagulation sanguine. Une caractéristique importante de la coagulation sanguine est que toutes les réactions principales se déroulent sur les membranes phospholipides des cellules et des microvésicules provenant de ces cellules et non dans le plasma 1,2,3. Les réactions membranaires dépendantes comprennent le processus de début de la coagulation (sur les membranes cellulaires du sous-endothhélium, l’endothélium enflammé ou les cellules immunitaires activées, avec la participation d’un facteur tissulaire), toutes les réactions de la principale activation en cascade des facteurs IX, X, prothrombine; activation du facteur XI par la thrombine (sur les membranes des plaquettes activées, des érythrocytes, des lipoprotéines et des microvésicules); réactions de la voie de la protéine C; inactivation des enzymes de coagulation (sur les membranes des cellules endothéliales avec la participation de cofacteurs de thrombomoduline, récepteur de la protéine endothéliale C, sulfate d’héparane); et les réactions de la voie de contact (sur les membranes des plaquettes et de certaines microvésicules avec la participation de cofacteurs inconnus). Ainsi, il est impossible d’étudier la coagulation sanguine sans étudier l’interaction de diverses protéines plasmatiques avec la membrane des cellules sanguines.
Cet article décrit une méthode basée sur la cytométrie en flux pour caractériser l’interaction des protéines avec les membranes lipidiques des cellules ou des microvésicules. Cette approche a été initialement proposée pour étudier l’interaction du plasma sanguin avec les plaquettes et les vésicules phospholipides artificielles. De plus, la plupart des protéines étudiées interagissent directement avec les phospholipides membranaires chargés négativement, en particulier avec la phosphatidylsérine 4,5. De plus, il existe des protéines dont l’interaction avec la membrane est médiée par des récepteurs spéciaux6.
Une capacité importante de la cytométrie en flux est la discrimination entre les ligands libres et liés sans séparation supplémentaire. Cette caractéristique de la cytométrie permet l’étude de la liaison à l’équilibre des ligands à l’extrémité et aide à effectuer des mesures cinétiques continues. La technique n’est pas sophistiquée et ne nécessite pas de préparation d’échantillon complexe. La cytométrie en flux est activement utilisée pour étudier quantitativement la dynamique d’interaction entre les peptides fluorescents, les récepteurs et les protéines G dans les neutrophiles intacts et perméables aux détergents7. Cette approche est également applicable pour explorer les interactions protéine-ADN et la cinétique de l’activité des endonucléases en temps réel8. Au fil du temps, cette méthode a été utilisée pour étudier quantitativement les interactions protéine-protéine à haute affinité avec les vésicules lipidiques purifiées9, ou, plus généralement, avec les protéines membranaires exprimées dans un système d’expression cellulaire Sf9 très efficace10. Des méthodes quantitatives ont également été décrites pour caractériser les interactions protéine-liposome en utilisant la cytométrie en flux pour les protéines transmembranaires11.
Cette technique utilise des perles d’étalonnage auto-fabriquées pour éviter d’utiliser des perles disponibles dans le commerce7. Les billes d’étalonnage utilisées précédemment7 étaient destinées à fonctionner avec la fluorescéine, ce qui limitait considérablement l’assortiment de ligands fluorescents accessibles sur les protéines. En outre, cet article offre une nouvelle façon d’acquérir et d’analyser des données cinétiques pour une résolution temporelle raisonnable. Bien que cette méthode soit décrite pour les vésicules phospholipides artificielles, il n’y a pas de limites évidentes à son adaptabilité aux cellules, aux vésicules naturelles ou aux vésicules phospholipides artificielles avec une composition lipidique différente. La méthode décrite ici permet d’estimer les paramètres d’interaction (kon, koff) etd’équilibre (K d) et facilite la caractérisation quantitative du nombre de sites de liaison aux protéines sur la membrane. Notez que cette technique fournit une estimation approximative du nombre de sites de liaison. Les avantages de la méthode sont sa simplicité relative, son accessibilité et son adaptabilité aux cellules natives et aux microvésicules naturelles et artificielles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

Dans le corps humain, la plupart des principales réactions physiologiques impliquées dans la réponse immunitaire et la coagulation sanguine se déroulent sur les membranes des cellules. Une première étape importante dans toute réaction dépendante de la membrane est la liaison des protéines sur la membrane des phospholipides. Une approche pour étudier l’interaction des protéines avec les membranes lipidiques a été développée en utilisant des protéines marquées par fluorescence et la cytométrie en flux. Cette méthode permet d’étudier les interactions protéine-membrane à l’aide de cellules vivantes et de vésicules phospholipides naturelles ou artificielles. L’avantage de cette méthode est la simplicité et la disponibilité des réactifs et des équipements. Dans cette méthode, les protéines sont marquées à l’aide de colorants fluorescents. Cependant, des protéines auto-fabriquées et disponibles dans le commerce, marquées par fluorescence, peuvent être utilisées. Après conjugaison avec un colorant fluorescent, les protéines sont incubées avec une source de la membrane phospholipidique (microvésicules ou cellules), et les échantillons sont analysés par cytométrie en flux. Les données obtenues peuvent être utilisées pour calculer les constantes cinétiques et l’équilibre Kd. En outre, il est possible d’estimer le nombre approximatif de sites de liaison aux protéines sur la membrane phospholipidique à l’aide de billes d’étalonnage spéciales.

La méthode de cytométrie en flux décrite ici est utilisée pour caractériser la liaison des protéines de coagulation plasmatique aux plaquettes activées. En outre, les vésicules phospholipides PS:PC 20:80 ont été appliquées comme système modèle. Cet article se concentre principalement sur les vésicules phospholipides artificielles à titre d’exemple. Les paramètres du cytomètre, en particulier la tension du tube photomultiplicateur (PMT) et la compensation doivent être sélectionnés pour chaque disposi...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Ici, nous décrivons un ensemble de méthodes pour caractériser l’interaction des protéines avec les membranes de cellules ou de microvésicules.

Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

En utilisant cette méthode de cytométrie en flux de quantité, les chercheurs peuvent calculer les coutumes cinétiques et d’équilibre de l’interaction membranaire apportée et estimer le nombre de protéines apportées par les sites sur la membrane PPH. Les avantages de cette méthode sont la simplicité et la disponibilité des réactifs et des équipements. Cette méthode est exclusivement destinée à la recherche fondamentale.Le protocole a été développé pour étudier les interactions des lipides protéiques dans le calcul du sang et peut être utilisé dans d’autres domaines pour caractériser l’interaction des protéines avec diverses membranes lipidiques. La méthode peut être utilisée pour l’évaluation quantitative de la dynamique de liaison des ligands sur les différentes cellules et types de ligands. Commencez les expériences de liaison cinétique en diluant les vésicules de phospholipides dans le tampon de Tyrode à une concentration d’un micromolaire et un volume total de 250 microlitres.Ensuite, mélangez le facteur de coagulation X ou FX FD marqué par fluorescence et une concentration de 500 nanomolaires avec les vésicules phospholipides dans un rapport de un à un pour obtenir un volume total de 500 microlitres. Injecter immédiatement 500 microlitres de la suspension mélangée dans le cytomètre en flux. À un débit avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et un filtre d’émission de 585 nanomètres; avec une largeur de 42 pour le canal FL deux.Ensuite, mesurez la fluorescence moyenne dans le canal FL quatre avec une excitation à 633 nanomètres et un filtre d’émission à 660 nanomètres avec une largeur de 20. Lorsque la saturation de liaison est atteinte, diluez rapidement l’échantillon 20 fois avec le tampon de Tyrode et surveillez la dissociation jusqu’à ce qu’une fluorescence de base, ou un plateau, soit atteinte. Pour les expériences de liaison à l’équilibre, incubez cinq vésicules phospholipides artificielles micromolaires avec des concentrations variables de FX FD de zéro à 1000 nanomolaires dans le tampon de Tyrode pendant 20 minutes.Après l’incubation, diluer chaque échantillon de 20 fois pour obtenir un volume final de 200 microlitres avec le tampon de Tyrode, puis analyser l’échantillon dilué par cytométrie en flux dans les 30 secondes. Pour analyser les données, exportez les expériences au format FSC du logiciel d’acquisition de données de cytométrie vers le logiciel de cytomètre pour l’analyse des données. En choisissant le fichier, puis en cliquant sur les onglets Exporter et Fichiers FSC.Une fois cela fait, ouvrez les fichiers FCS dans le logiciel cytométrique en sélectionnant les fichiers sur l’ordinateur et en les faisant glisser vers l’espace de travail du programme. Pour le contrôle des microvésicules, identifier la région des microvésicules par fluorescence du colorant lipophile, DIC 16 trois. Utilisez ensuite le bouton de tracé dans la feuille de calcul pour créer un diagramme à points SSC à partir de FL deux D I C 16 dans les coordonnées du journal.Choisissez ensuite le bouton de porte rectangulaire pour dessiner une zone de grille. Pour analyser les expériences cinétiques, créez un diagramme de points en utilisant les coordonnées de fluorescence au fil du temps pour la région des vésicules. Ensuite, exportez les données sur le changement de fluorescence au fil du temps au format CSV; en choisissant l’échantillon et en cliquant avec le bouton droit sur l’onglet d’exportation, puis en choisissant FL quatre fois dans les paramètres, sélectionnez le répertoire à enregistrer avant de cliquer sur le format CSV sélectionné et d’appuyer sur l’onglet d’exportation.Après le transfert, ouvrez le fichier CSV dans un logiciel statistique pour calculer la fluorescence et le temps de la moyenne mobile simple pour chaque 1000 événements approximatifs d’un graphique de la dépendance de la fluorescence de moyenne mobile unique sur le temps sous l’hypothèse de la dépendance exponentielle et utilisez la valeur pour calculer la constante d’association cinétique à l’aide d’une équation. Calculez ensuite la constante de dissociation cinétique à l’aide de l’équation décrite précédemment. Pour analyser la date du test de liaison à l’équilibre, déterminer la fluorescence moyenne de FX FD dans la région des vésicules pour chaque concentration sélectionnée de FX FD, puis approximer la dépendance de la fluorescence du facteur lié de la concentration du facteur ajouté dans l’hypothèse de liaison à site unique.Calculez les paramètres de liaison moyens à l’aide d’une équation à partir de trois répétitions indépendantes au minimum. Procéder à la préparation des billes calibrées en incubant des plaquettes filtrées en gel avec du calcium IANA 4A vingt-trois, cent quatre-vingt-sept en présence de chlorure de calcium de 2,5 millimolaires pendant 10 minutes à température ambiante. Les plaquettes activées ajoutent-elles les différentes concentrations de FX FD et incubent-elles les plaquettes avec du formaldéhyde à deux pour cent de volume.Après une heure, arrêtez la réaction en incubant les plaquettes avec trois glycine molaires et 5% de BSA pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, purifiez le mélange du colorant non réagi avec une centrifugation à 400 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnate avant de le réutiliser dans le tampon de Tyrode contenant 0,5% de BSA.Ensuite, mesurez le niveau de fluorescence des billes d’étalonnage dans chaque échantillon à l’aide d’un spectrofluoromètre, puis à l’aide du cytomètre en flux. Déterminez le nombre de perles dans chaque échantillon à l’aide d’un compteur de cellules. Convertissez l’intensité de fluorescence de chaque échantillon de billes respectif en concentration de colorant fluorescent soluble à l’aide d’un spectrofluoromètre et recalculez la concentration de colorant fluorescent pour le nombre de molécules de spectrofluoromètre.Créer un graphique de dépendance de la fluorescence moyenne des billes dans un cytomètre en flux sur le nombre de molécules de flurophore pour chaque échantillon. Ensuite, approximez la dépendance par proportionnalité de ligne à l’aide de l’ajustement d’analyse et ajustez les onglets linéaires dans l’ordre. À partir de l’approximation dans l’équation, calculez le facteur de conversion de la fluorescence moyenne en sites de liaison.Calculez plus tard le nombre apparent de sites de liaison par vésicule d’intérêt. L’analyse représentative montre la fermeture des vésicules lipidiques artificielles au phosphore d’une taille d’un micromètre avec le colorant fluorescent lipophile incorporé, le colorant I C 16, la porte a été fixée sur la base d’un échantillon contenant des vésicules lipidiques artificielles de même taille sans le colorant fluorescent. La cinétique de la protéine se liant aux vésicules a été analysée au premier stade en collectant l’échantillon en continu.Les données obtenues ont été analysées par cytométrie en flux. Les mesures cytométriques en flux doivent commencer dès que possible après le mélange des solutions et la dilution avec le tampon de Tyrode. La méthode proposée pourrait être complétée par une résonance plasmatique de surface pour étudier les interactions membranaires qui sont très sensibles avec une bonne résolution temporaire et ne nécessitent pas de livraison Le principal avantage de cette méthode est son accessibilité et sa simplicité.

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