Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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Die Autoren wurden durch ein Stipendium der Russian Science Foundation 20-74-00133 unterstützt.

1. Markierung fluoreszierender Proteine
<ol><li>Materialaufbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 1 M Natriumbicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 vor, lagern Sie ihn bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb einer Woche.</li>
		<li>Bereiten Sie 1,5 m Hydroxylaminhydrochloridpuffer, pH 8,5, unmittelbar vor Gebrauch vor.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mg / ml Lösung mit Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid vor. HINWEIS: Diese Lösung kann einen Monat lang b...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

Die vorgeschlagene Methode kann für eine grobe Charakterisierung der Wechselwirkung von Proteinen mit Phospholipidmembranen aus verschiedenen Quellen und Zusammensetzungen angepasst werden. Die hier beschriebene quantitative Durchflusszytometrie räumt der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) in mehreren Parametern zu. Insbesondere hat es eine geringere Empfindlichkeit und Zeitauflösung und erfordert eine fluoreszierende Markierung von Proteinen. Die fluoreszierende Markierung kann bei vielen Proteinen zu einer Verände...

Biomembranen trennen den inneren Inhalt tierischer Zellen und des extrazellulären Raums. Beachten Sie, dass Membranen auch Mikrovesikel umgeben, die während des Lebenszyklus der Zelle gebildet wurden, und Organellen. Die Zellmembran besteht überwiegend aus Lipiden und Proteinen. Membranproteine übernehmen Signal-, Struktur-, Transport- und Klebefunktionen. Die Lipiddoppelschicht ist aber auch essentiell für die Wechselbeziehung der tierischen Zelle mit dem extrazellulären Raum. Diese Arbeit schlägt eine Methode vor, um die periphere Wechselwirkung externer Proteine mit der Lipidmembran zu untersuchen.
Das auffälligste Beispiel für Reaktionen, die auf der äußeren Membranschicht einer tierischen Zelle auftreten, ist die Blutgerinnungsreaktion. Ein wichtiges Merkmal der Blutgerinnung ist, dass alle Hauptreaktionen auf den Phospholipidmembranen von Zellen und Mikrovesikeln ablaufen, die aus diesen Zellen entstehen, und nicht im Plasma 1,2,3. Membranabhängige Reaktionen umfassen den Prozess des Startens der Koagulation (auf den Zellmembranen des Subendothels, des entzündeten Endothels oder der aktivierten Immunzellen, unter Beteiligung eines Gewebefaktors), alle Reaktionen der Hauptkaskadenaktivierung der Faktoren IX, X, Prothrombin; Aktivierung von Faktor XI durch Thrombin (auf den Membranen von aktivierten Blutplättchen, Erythrozyten, Lipoproteinen und Mikrovesikeln); Reaktionen des Protein-C-Signalwegs; Inaktivierung von Gerinnungsenzymen (auf den Membranen von Endothelzellen unter Beteiligung von Thrombomodulin-Cofaktoren, Endothelprotein-C-Rezeptor, Heparansulfat); und Kontaktwegreaktionen (auf Membranen von Blutplättchen und einigen Mikrovesikeln unter Beteiligung unbekannter Cofaktoren). Daher ist es unmöglich, die Blutgerinnung zu untersuchen, ohne die Wechselwirkung verschiedener Plasmaproteine mit der Membran von Blutzellen zu untersuchen.
Dieser Beitrag beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Lipidmembranen von Zellen oder Mikrovesikeln. Dieser Ansatz wurde ursprünglich vorgeschlagen, um die Wechselwirkung von Blutplasma mit Blutplättchen und künstlichen Phospholipidvesikeln zu untersuchen. Darüber hinaus interagieren die meisten der untersuchten Proteine direkt mit negativ geladenen Membranphospholipiden, insbesondere mit Phosphatidylserin 4,5. Hinzu kommen Proteine, deren Interaktion mit der Membran durch spezielle Rezeptoren vermitteltwird 6.
Eine wichtige Fähigkeit der Durchflusszytometrie ist die Unterscheidung zwischen freien und gebundenen Liganden ohne zusätzliche Trennung. Diese Eigenschaft der Zytometrie ermöglicht die Untersuchung der Ligandengleichgewichtsbindung am Endpunkt und hilft bei der Durchführung kontinuierlicher kinetischer Messungen. Die Technik ist unausgereift und erfordert keine komplexe Probenvorbereitung. Die Durchflusszytometrie wird aktiv eingesetzt, um die Dynamik der Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Peptiden, Rezeptoren und G-Proteinen in intakten und waschmitteldurchlässigen Neutrophilenquantitativ zu untersuchen 7. Dieser Ansatz eignet sich auch für die Erforschung von Protein-DNA-Interaktionen und der Kinetik der Endonukleaseaktivitätin Echtzeit 8. Im Laufe der Zeit wurde diese Methode verwendet, um hochaffine Protein-Protein-Interaktionen mit gereinigten Lipidvesikeln9 oder, allgemeiner, mit Membranproteinen, die in einem hocheffizienten Sf9-Zellexpressionssystem10 exprimiert werden, quantitativ zu untersuchen. Quantitative Methoden wurden auch zur Charakterisierung von Protein-Liposom-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie für Transmembranproteinebeschrieben 11.
Diese Technik verwendet selbst hergestellte Kalibrierperlen, um die Verwendung von kommerziell erhältlichen Perlenzu vermeiden 7. Die zuvorverwendeten Kalibrierperlen 7 sollten mit Fluorescein arbeiten, was das Sortiment an zugänglichen fluoreszierenden Liganden auf den Proteinen erheblich einschränkte. Darüber hinaus bietet dieses Dokument eine neue Möglichkeit, kinetische Daten für eine angemessene Zeitauflösung zu erfassen und zu analysieren. Obwohl diese Methode für künstliche Phospholipidvesikel beschrieben wird, gibt es keine offensichtlichen Einschränkungen für ihre Anpassungsfähigkeit an Zellen, natürliche Vesikel oder künstliche Phospholipidvesikel mit einer anderen Lipidzusammensetzung. Das hierin beschriebene Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Parameter Wechselwirkung (kon, koff) und Gleichgewicht (Kd) und erleichtert die quantitative Charakterisierung der Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Membran. Beachten Sie, dass diese Technik eine ungefähre Schätzung der Anzahl der Bindungsstellen liefert. Die Vorteile der Methode sind ihre relative Einfachheit, Zugänglichkeit und Anpassungsfähigkeit an native Zellen und natürliche und künstliche Mikrovesikel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

Im menschlichen Körper verlaufen die meisten der wichtigsten physiologischen Reaktionen, die an der Immunantwort und der Blutgerinnung beteiligt sind, auf den Membranen der Zellen. Ein wichtiger erster Schritt in jeder membranabhängigen Reaktion ist die Bindung von Protein an die Phospholipidmembran. Ein Ansatz zur Untersuchung der Proteinwechselwirkung mit Lipidmembranen wurde unter Verwendung fluoreszierend markierter Proteine und Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen mit lebenden Zellen und natürlichen oder künstlichen Phospholipid-Vesikeln. Der Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Bei dieser Methode werden Proteine mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Es können jedoch sowohl selbst hergestellte als auch kommerziell erhältliche, fluoreszierend markierte Proteine verwendet werden. Nach der Konjugation mit einem fluoreszierenden Farbstoff werden die Proteine mit einer Quelle der Phospholipidmembran (Mikrovesikel oder Zellen) inkubiert und die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die erhaltenen Daten können zur Berechnung der kinetischen Konstanten und des Gleichgewichts Kd verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Phospholipidmembran mit speziellen Kalibrierperlen abzuschätzen.

Das hierin beschriebene Durchflusszytometrieverfahren wird verwendet, um die Bindung von Plasmagerinnungsproteinen an aktivierte Blutplättchen zu charakterisieren. Zusätzlich wurden Phospholipidvesikel PS:PC 20:80 als Modellsystem eingesetzt. Diese Arbeit konzentriert sich hauptsächlich auf künstliche Phospholipidvesikel als Beispiel. Die Parameter des Zytometers, insbesondere die Photomultiplierröhrenspannung (PMT) und die Kompensation müssen für jedes spezifische Gerät, den Untersuchungsgegenstand (Zellen, kün...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Mit dieser Mengendurchflusszytometrie-Methode können Forscher die kinetischen und Gleichgewichtsbräuche der eingebrachten Membraninteraktion berechnen und die Anzahl der Proteine schätzen, die von Stellen auf der PPH-Membran eingebracht werden. Die Vorteile dieser Methode sind die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Diese Methode dient ausschließlich der Grundlagenforschung.Das Protokoll wurde entwickelt, um Proteinlipidwechselwirkungen in der Blutberechnung zu untersuchen, und kann in anderen Bereichen verwendet werden, um die Wechselwirkung von Proteinen mit verschiedenen Lipidmembranen zu charakterisieren. Die Methode kann für die Mengenbewertung der Ligandenbindungsdynamik an den verschiedenen Zellen und Ligandentypen verwendet werden. Beginnen Sie die kinetischen Bindungsexperimente, indem Sie die Phospholipidvesikel im Tyrode-Puffer auf eine Konzentration von einem Mikromolar und ein Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern verdünnen.Mischen Sie dann fluoreszierend markierten Gerinnungsfaktor X oder FX FD und eine Konzentration von 500 Nanomolar mit den Phospholipidvesikeln in einem Verhältnis von eins zu eins, um ein Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Injizieren Sie sofort 500 Mikroliter der gemischten Suspension in das Durchflusszytometer. Bei einer Durchflussrate mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einem Emissionsfilter von 585 Nanometern; mit einer Breite von 42 für Kanal FL zwei.Als nächstes messen Sie die mittlere Fluoreszenz in Kanal FL vier mit Anregung bei 633 Nanometern und Emissionsfilter bei 660 Nanometern mit einer Breite von 20. Wenn die Sättigung der Bindung erreicht ist, verdünnen Sie die Probe schnell um das 20-fache mit dem Tyrode-Puffer und überwachen Sie die Dissoziation, bis eine Basisfluoreszenz oder ein Plateau erreicht ist. Für Gleichgewichtsbindungsexperimente werden fünf mikromolare künstliche Phospholipidvesikel mit unterschiedlichen Konzentrationen von FX FD von null bis 1000 nanomolar im Tyrode-Puffer für 20 Minuten inkubiert.Nach der Inkubation verdünnen Sie jede Probe um das 20-fache auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern mit dem Puffer von Tyrode und analysieren Sie die verdünnte Probe dann innerhalb von 30 Sekunden durch Durchflusszytometrie. Um die Daten zu analysieren, exportieren Sie die Experimente im FSC-Format aus der Zytometrie-Datenerfassungssoftware in die Zytometersoftware zur Datenanalyse. Indem Sie die Datei auswählen und dann auf die Registerkarten Exportieren und FSC-Dateien klicken.Sobald Sie fertig sind, öffnen Sie die FCS-Dateien in der Zytometer-Software, indem Sie die Dateien auf dem Computer auswählen und die Dateien in den Arbeitsbereich des Programms ziehen. Für das Gating der Mikrovesikel identifizieren Sie den Bereich der Mikrovesikel durch Fluoreszenz des lipophilen Farbstoffs, DIC 16 drei. Verwenden Sie dann die Schaltfläche "Plot" im Arbeitsblatt, um aus FL zwei D I C 16 in Protokollkoordinaten einen Punktplot-SSC zu erstellen.Wählen Sie dann die rechteckige Gate-Taste, um einen Gating-Bereich zu zeichnen. Um die kinetischen Experimente zu analysieren, erstellen Sie ein Punktdiagramm unter Verwendung der Koordinaten der Fluoreszenz über die Zeit für die Region der Vesikel. Exportieren Sie als Nächstes die Daten über die Änderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit im CSV-Format;indem Sie Sample auswählen und mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte Export klicken, gefolgt von FL viermal in Parametern, wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern aus, bevor Sie auf das CSV-Format auswählen klicken und auf die Registerkarte Export klicken.Öffnen Sie nach der Übertragung die CSV-Datei in einer statistischen Software, um die einfache gleitende durchschnittliche Fluoreszenz und die Zeit für jeweils 1000 Ereignisse zu berechnen, nähern Sie sich einem Diagramm der Abhängigkeit der einzelnen gleitenden durchschnittlichen Fluoreszenz von der Zeit unter der Annahme der exponentiellen Abhängigkeit und verwenden Sie den Wert, um die kinetische Assoziationskonstante mit einer Gleichung zu berechnen. Berechnen Sie dann die kinetische Dissoziationskonstante mit der Gleichung wie zuvor beschrieben. Um das Datum des Gleichgewichtsbindungsassays zu analysieren, bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz von FX FD im Bereich der Vesikel für jede ausgewählte Konzentration von FX FD und nähern Sie sich dann der Abhängigkeit des gebundenen Faktors Fluoreszenz von der Konzentration des hinzugefügten Faktors unter der Annahme der Einzelplatzbindung an.Berechnen Sie die durchschnittlichen Bindungsparameter mit einer Gleichung aus mindestens drei unabhängigen Wiederholungen. Fahren Sie fort, kalibrierte Perlen vorzubereiten, indem Sie gelfiltrierte Blutplättchen mit Calcium IANA 4A dreiundzwanzig, einhundertsiebenundachtzig in Gegenwart von 2,5 Millimolar Calciumchlorid für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Addieren die aktivierten Blutplättchen die verschiedenen Konzentrationen von FX FD und inkubieren Sie die Blutplättchen mit zwei Volumenprozent Formaldehyd.Nach einer Stunde stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Blutplättchen mit drei molaren Glycin und 5% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann reinigen Sie die Mischung aus dem nicht umgesetzten Farbstoff mit Zentrifugation bei 400 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie das Supernat, bevor Sie das Pellet im Puffer von Tyrode mit 0,5% BSA wieder suspendieren.Als nächstes messen Sie den Fluoreszenzpegel der Kalibrierkügelchen in jeder Probe mit einem Spektrofluorometer und dann mit dem Durchflusszytometer. Bestimmen Sie die Anzahl der Perlen in jeder Probe mit Hilfe eines Zellzählers. Wandeln Sie die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Perlenprobe mit einem Spektrofluorometer in die Konzentration des löslichen Fluoreszenzfarbstoffs um und berechnen Sie die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration für die Anzahl der Spektrofluorometermoleküle neu.Erstellen Sie ein Abhängigkeitsdiagramm der durchschnittlichen Fluoreszenz der Kügelchen in einem Durchflusszytometer auf der Anzahl der Flurophormoleküle für jede Probe. Nähern Sie sich dann der Abhängigkeit durch die Linienproportionalität an, indem Sie die Analyse anpassen und lineare Tabs in der richtigen Reihenfolge anpassen. Berechnen Sie aus der Näherung in der Gleichung den Umrechnungsfaktor der mittleren Fluoreszenz zu Bindungsstellen.Berechnen Sie später die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Vesikel von Interesse. Die repräsentative Analyse zeigt Gating der künstlichen Phosphorlipidvesikel, die einen Mikrometer groß sind, mit dem eingearbeiteten lipophilen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff I C 16, das Gate wurde basierend auf einer Probe gesetzt, die die gleiche Größe künstliche Lipidvesikel ohne den Fluoreszenzfarbstoff enthielt. Die Kinetik des Proteins, das an die Vesikel bindet, wurde in der ersten Phase analysiert, indem die Probe kontinuierlich gesammelt wurde.Die gewonnenen Daten wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die durchflusszytometrischen Messungen sollten so schnell wie möglich nach dem Mischen der Lösungen und der Verdünnung mit dem Puffer von Tyrode beginnen. Die vorgeschlagene Methode könnte mit Oberflächenplasmaresonanz für die Untersuchung von Membranwechselwirkungen ergänzt werden, die hochempfindlich mit guter temporärer Auflösung ist und keine Lieferung erfordert Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Zugänglichkeit und Einfachheit.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Forschung

Biochemie

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Schnelle Beurteilung der Qualität von Membranproteinen durch Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...