Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

המחברים נתמכו על ידי מענק של הקרן הרוסית למדע 20-74-00133.

1. תיוג חלבונים פלואורסצנטיים
<ol><li>הכנת חומרים<ol>
<li>הכן 1 M נתרן bicarbonate buffer, pH 9.0, לאחסן אותו ב 4 ° C, ולהשתמש בו בתוך שבוע אחד.</li>
		<li>מכינים 1.5 M הידרוקסילאמין הידרוכלוריד בופר, pH 8.5, מיד לפני השימוש.</li>
		<li>הכינו תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל של צבע פלואורסצנטי (ראו טבלת החומרים) בדימתילסולפו...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

ניתן להתאים את השיטה המוצעת לאפיון גס של האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות פוספוליפידיות ממקורות והרכבים שונים. הציטומטריה הכמותית של הזרימה המתוארת כאן מוותרת על תהודת פלסמון פני השטח (SPR) במספר פרמטרים. בפרט, יש לו רגישות נמוכה יותר ורזולוציית זמן והוא דורש תיוג פלואורסצנטי של חלבונים. ?...

ביוממברנים מפרידים בין התוכן הפנימי של תאי בעלי החיים לבין החלל החוץ-תאי. שימו לב שממברנות מקיפות גם מיקרו-וסיקלים שנוצרו במהלך מחזור החיים של התא ובאברונים. קרום התא מורכב בעיקר מליפידים וחלבונים. חלבוני ממברנה מבצעים תפקודי איתות, מבניים, הובלה ודבקים. עם זאת, דו-שכבת השומנים חיונית גם ליחסי הגומלין של תא החיה עם המרחב החוץ-תאי. מאמר זה מציע שיטה לחקר האינטראקציה ההיקפית של חלבונים חיצוניים עם קרום השומנים.
הדוגמה הבולטת ביותר לתגובות המתרחשות בשכבת הממברנה החיצונית של תא בעל חיים היא תגובת קרישת הדם. תכונה חשובה של קרישת דם היא שכל התגובות העיקריות ממשיכות על ממברנות הפוספוליפידים של תאים ומיקרו-וסיקלים הנובעים מתאים אלה ולא בפלזמה 1,2,3. תגובות תלויות ממברנה כוללות את התהליך של קרישה התחלתית (על קרומי התאים של תת-האנדותל, אנדותל מודלק, או תאי חיסון פעילים, בהשתתפות גורם רקמה), כל התגובות של הפעלת המפל העיקרי של גורמים IX, X, פרותרומבין; הפעלה של גורם XI על ידי טרומבין (על הממברנות של טסיות מופעלות, אריתרוציטים, ליפופרוטאינים ומיקרו-וסיקלים); תגובות של מסלול חלבון C; אי-פעילות של אנזימי קרישה (על הממברנות של תאי האנדותל בהשתתפות קומפקטורים טרומבודולין, קולטן חלבון אנדותל C, הפארן סולפט); ותגובות מסלול מגע (על ממברנות של טסיות דם וכמה מיקרו-סיביות בהשתתפות גורמים משלימים לא ידועים). לכן, אי אפשר לחקור קרישת דם מבלי לחקור את האינטראקציה של חלבוני פלזמה שונים עם קרום תאי הדם.
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת זרימה-ציטומטריה לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות ליפידים של תאים או מיקרו-וסיקלים. גישה זו הוצעה בתחילה כדי לחקור את האינטראקציה של פלזמה בדם עם טסיות דם ושלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות. יתר על כן, רוב החלבונים שנחקרו מתקשרים ישירות עם פוספוליפידים של ממברנה טעונה שלילית, במיוחד עם פוספטידיל-סרין 4,5. בנוסף, ישנם חלבונים שהאינטראקציה שלהם עם הממברנה מתווכת על ידי קולטנים מיוחדים6.
יכולת חשובה של ציטומטריית זרימה היא הבחנה בין ליגנדות חופשיות וכבולות ללא הפרדה נוספת. תכונה זו של ציטומטריה מאפשרת לחקור את קשירת שיווי המשקל של ליגנד בנקודת הקצה ומסייעת בביצוע מדידות קינטיות רציפות. הטכניקה אינה מתוחכמת ואינה דורשת הכנת דגימה מורכבת. ציטומטריית זרימה משמשת באופן פעיל כדי לחקור באופן כמותי את הדינמיקה של אינטראקציה בין פפטידים פלואורסצנטיים, קולטנים וחלבוני G בנויטרופילים שלמים וחדירי דטרגנטים7. גישה זו ישימה גם לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א והקינטיקה של פעילות אנדונוקלאז בזמן אמת8. עם הזמן, שיטה זו שימשה למחקר כמותי של אינטראקציות חלבון-חלבון בעלות זיקה גבוהה עם שלפוחיות שומניםמטוהרות 9, או, באופן כללי יותר, עם חלבוני ממברנה המתבטאים במערכת ביטוי יעילה ביותר של תאי Sf910. שיטות כמותיות תוארו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-ליפוזום באמצעות ציטומטריה של זרימה עבור חלבוני טרנס-ממברנה11.
טכניקה זו משתמשת בחרוזי כיול מתוצרת עצמית כדי להימנע משימוש בחרוזים זמינים מסחרית7. חרוזי הכיול ששימשו בעבר7 נועדו לעבוד עם פלואורסציין, מה שהגביל באופן מהותי את מבחר הליגנדות הפלואורסצנטיות הנגישות על החלבונים. בנוסף, מאמר זה מציע דרך חדשה לרכוש ולנתח נתונים קינטיים לרזולוציה סבירה של זמן. למרות ששיטה זו מתוארת עבור שלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות, אין מגבלות ברורות על יכולת ההסתגלות שלה לתאים, בועיות טבעיות או שלפוחיות פוספוליפיד מלאכותיות עם הרכב שומנים שונה. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה של הפרמטרים של אינטראקציה (kon, koff) ושיווי משקל (Kd) ומאפשרת אפיון כמותי של מספר אתרי קשירת החלבונים על הממברנה. שים לב שטכניקה זו מספקת הערכה משוערת של מספר אתרי הקישור. היתרונות של השיטה הם הפשטות היחסית שלה, הנגישות ויכולת ההסתגלות שלה לתאים מקומיים ולמיקרו-ווסיקלים טבעיים ומלאכותיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

בגוף האדם, רוב התגובות הפיזיולוגיות העיקריות המעורבות בתגובה החיסונית ובקרישת הדם ממשיכות על קרומי התאים. צעד ראשון חשוב בכל תגובה התלויה בממברנה הוא קשירת חלבון על קרום הפוספוליפידים. גישה לחקר אינטראקציה של חלבונים עם ממברנות שומנים פותחה באמצעות חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין חלבונים לממברנה באמצעות תאים חיים ושלפוחיות פוספוליפיד טבעיות או מלאכותיות. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות והזמינות של ריאגנטים וציוד. בשיטה זו, חלבונים מסומנים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. עם זאת, ניתן להשתמש הן בחלבונים מתוצרת עצמית והן באופן מסחרי, המסומנים באופן פלואורסצנטי. לאחר הצמדה עם צבע פלואורסצנטי, החלבונים מודגרים עם מקור של קרום פוספוליפידים (microvesicles או תאים), והדגימות מנותחות על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להשתמש בנתונים המתקבלים כדי לחשב את הקבועים הקינטיים ואת שיווי המשקל Kd. בנוסף, ניתן להעריך את המספר המשוער של אתרי קשירת חלבונים על קרום הפוספוליפידים באמצעות חרוזי כיול מיוחדים.

שיטת ציטומטריית הזרימה המתוארת כאן משמשת לאפיון קשירת חלבוני קרישת פלזמה לטסיות דם מופעלות. בנוסף, שלפוחיות פוספוליפיד PS:PC 20:80 יושמו כמערכת מודל. מאמר זה מתמקד בעיקר בשלפוחיות פוספוליפידים מלאכותיות כדוגמה. הפרמטרים של הציטומטר, בפרט, מתח הצינור הפוטומולטיפלייר (PMT) והפיצוי חייבים להיבחר ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

כאן, אנו מתארים קבוצה של שיטות לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות של תאים או microvesicles.

ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

באמצעות שיטת ציטומטריה של זרימת כמות זו חוקרים יכולים לחשב את המנהגים הקינטיים ושיווי המשקל של אינטראקציה עם ממברנה ולהעריך את מספר החלבון המובא על ידי אתרים על ממברנת PPH. היתרונות של שיטה זו הם הפשטות והזמינות של ריאגנטים וציוד. שיטה זו מיועדת אך ורק למחקר בסיסי.הפרוטוקול פותח כדי לחקור אינטראקציות של שומנים בחלבונים בחישוב הדם, וניתן להשתמש בו באזורים אחרים כדי לאפיין את האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות שומנים שונות. השיטה יכולה לשמש להערכת כמות של דינמיקת קשירת ליגנד על התאים השונים וסוגי הליגנד. התחילו את ניסויי הקשירה הקינטית על ידי דילול שלפוחיות פוספוליפידים בחיץ של טירוד לריכוז של מיקרומולר אחד ונפח כולל של 250 מיקרוליטרים.לאחר מכן ערבבו את גורם הקרישה הפלואורסצנטי X או FX FD וריכוז של 500 ננומולרים עם שלפוחיות הפוספוליפיד ביחס של אחד לאחד כדי לקבל נפח כולל של 500 מיקרוליטרים. מיד להזריק 500 microliters של ההשעיה המעורבת לתוך ציטומטר הזרימה. בקצב זרימה עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ומסנן פליטה של 585 ננומטר;ברוחב של 42 לערוץ FL 2.לאחר מכן למדוד את הפלואורסצנציה הממוצעת בערוץ FL 4 עם עירור ב 633 ננומטר ומסנן פליטה ב 660 ננומטר עם רוחב של 20. כאשר הרוויה של הקשירה מושגת, דיללו במהירות את הדגימה פי 20 עם החיץ של טירוד, ועקבו אחר הדיסוציאציה עד שמגיעים לפלואורסצנציה בסיסית, או מישור. עבור ניסויים קושרי שיווי משקל, דגירה של חמישה בועיות פוספוליפידים מלאכותיות מיקרומולריות עם ריכוזים משתנים של FX FD מאפס עד 1000 ננומולארים במאגר של Tyrode למשך 20 דקות.לאחר הדגירה דיללו כל דגימה פי 20 לנפח סופי של 200 מיקרוליטרים עם המאגר של טירוד ואז נתחו את הדגימה המדוללת על ידי ציטומטריית זרימה תוך 30 שניות. כדי לנתח את הנתונים, יש לייצא את הניסויים בפורמט FSC מתוכנת רכישת נתונים ציטומטריה לתוכנת ציטומטר לניתוח נתונים. על-ידי בחירת הקובץ ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסיות ייצוא וקבצי FSC.לאחר שתסיים לפתוח את קבצי FCS לתוכנת ציטומטר על-ידי בחירת הקבצים במחשב וגרירת הקבצים לסביבת העבודה של התוכנית. עבור gating microvesicles, לזהות את האזור של microvesicles על ידי פלואורסצנציה של צבע lipophilicic, DIC 16 שלוש. לאחר מכן השתמש בלחצן העלילה בגליון העבודה כדי ליצור תרשים נקודה SSC מ- FL שני D I C 16 בקואורדינטות יומן.לאחר מכן בחר את לחצן השער המלבני כדי לצייר אזור גידור. כדי לנתח את הניסויים הקינטיים ליצור תרשים נקודה באמצעות הקואורדינטות של פלואורסצנציה לאורך זמן עבור האזור של הבועיות. לאחר מכן, ייצא את הנתונים על השינוי בפלואורסצנציה לאורך זמן בתבנית CSV;על ידי לחיצה לדוגמה וימינה על כרטיסיית הייצוא, ולאחר מכן בחירת FL ארבע פעמים בפרמטרים, בחר ספריה לשמירה לפני לחיצה על פורמט CSV בחר ולחיצה על כרטיסיית הייצוא.לאחר ההעברה, פתח את קובץ ה- CSV בתוכנה סטטיסטית כדי לחשב את הממוצע הנע הפשוט פלואורסצנציה וזמן עבור כל 1000 אירועים בקירוב גרף של התלות של הפלואורסצנציה הממוצע הנע הבודד בזמן תחת ההנחה של תלות מעריכית והשתמש בערך כדי לחשב את קבוע הקשר הקינטי באמצעות משוואה. לאחר מכן חשב את קבוע הדיסוציאציה הקינטית באמצעות המשוואה כפי שתואר קודם לכן. כדי לנתח את תאריך בדיקת קשירת שיווי המשקל, קבעו את הפלואורסצנציה הממוצעת של FX FD באזור הבועיות עבור כל ריכוז נבחר של FX FD ולאחר מכן העריכו את התלות של הפלואורסצנציה של הגורם המאוגד מריכוז הגורם הנוסף בהנחה של קשירת אתר יחיד.חישוב הפרמטרים המחייבים הממוצעים באמצעות משוואה משלוש חזרות בלתי תלויות לכל הפחות. המשך להכין חרוזים מכוילים על ידי דגירה של טסיות ג'ל מסוננות עם סידן IANA 4A עשרים ושלוש, מאה ושמונים ושבע בנוכחות 2.5 מילימולאר סידן כלוריד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. האם הטסיות המופעלות מוסיפות את הריכוזים השונים של FX FD ומדגירות את הטסיות עם שני נפחים אחוזי פורמלדהיד.לאחר שעה אחת, יש להפסיק את התגובה על ידי דגירה של טסיות הדם עם שלושה גליצין טוחנים ו-5% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לטהר את התערובת מהצבע שלא שוחזר עם צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את הסופר-נייט לפני שימוש חוזר בכדור במאגר של Tyrode המכיל 0.5% BSA.לאחר מכן, מדוד את רמת הפלואורסצנציה של חרוזי הכיול בכל דגימה באמצעות ספקטרופלואורומטר ולאחר מכן השתמש בציטומטר הזרימה. קבע את מספר החרוזים בכל דגימה בעזרת מונה תאים. המר את עוצמת הפלואורסצנציה של כל דגימת חרוזים מתאימה לריכוז של צבע פלואורסצנטי מסיס באמצעות ספקטרופלואורומטר וחשב מחדש את ריכוז הצבע הפלואורסצנטי עבור מספר מולקולות הספקטרופלואורומטר.צור גרף תלות של הפלואורסצנציה הממוצעת של החרוזים בציטומטר זרימה על מספר מולקולות הפלורופורה עבור כל דגימה. לאחר מכן הערך את התלות לפי מידתיות קו באמצעות התאמת הניתוח והתאים לכרטיסיות ליניאריות לפי הסדר. מהקירוב במשוואה, חשב את מקדם ההמרה של הפלואורסצנציה הממוצעת לאתרים מחייבים.מאוחר יותר לחשב את המספר הנראה לעין של אתרי הקשירה לכל שלפוחית של ריבית. הניתוח הייצוגי מראה גידור של שלפוחיות השומנים הזרחניים המלאכותיים שגודלן הוא מיקרומטר אחד בגודלו עם הצבע הפלואורסצנטי הליפופילי המשולב, צבע I C 16, השער נקבע על סמך דגימה המכילה בועיות ליפידים מלאכותיות באותו גודל ללא הצבע הפלואורסצנטי. הקינטיקה של קשירת החלבון לבועיות נותחה בשלב הראשון על ידי איסוף הדגימה ברציפות.הנתונים שהתקבלו נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. המדידות הציטומטריות של הזרימה צריכות להתחיל בהקדם האפשרי לאחר ערבוב הפתרונות ודילול עם המאגר של טירוד. ניתן להשלים את השיטה המוצעת עם תהודת פלזמה על פני השטח לחקר אינטראקציות ממברנה מובאות שהיא רגישה מאוד עם רזולוציה זמנית טובה ואינה דורשת הבאת אספקה היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הנגישות והפשטות שלה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...