Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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लेखकों को रूसी विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 20-74-00133 द्वारा समर्थित किया गया था।

1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग
<ol><li>सामग्री की तैयारी<ol>
<li>1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट बफर, पीएच 9.0 तैयार करें, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और एक सप्ताह के भीतर इसका उपयोग करें।</li>
		<li>उपयोग से तुरंत ?...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

प्रस्तावित विधि को विभिन्न स्रोतों और रचनाओं से फॉस्फोलिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत के किसी न किसी लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री कई म...

बायोमेम्ब्रेन पशु कोशिकाओं और बाह्य अंतरिक्ष की आंतरिक सामग्री को अलग करते हैं। ध्यान दें कि झिल्ली कोशिका के जीवन चक्र और ऑर्गेनेल के दौरान गठित माइक्रोवेसिकल्स को भी घेरती है। कोशिका झिल्ली मुख्य रूप से लिपिड और प्रोटीन से बना होता है। झिल्ली प्रोटीन सिग्नलिंग, संरचनात्मक, परिवहन और चिपकने वाला कार्य करते हैं। हालांकि, बाह्य अंतरिक्ष के साथ पशु कोशिका के अंतर्संबंध के लिए लिपिड बाइलेयर भी आवश्यक है। यह पत्र लिपिड झिल्ली के साथ बाहरी प्रोटीन की परिधीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है।
एक पशु कोशिका की बाहरी झिल्ली परत पर होने वाली प्रतिक्रियाओं का सबसे हड़ताली उदाहरण रक्त जमावट प्रतिक्रिया है। रक्त जमावट की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि सभी मुख्य प्रतिक्रियाएं इन कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाओं और माइक्रोवेसिकल्स के फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं, न कि प्लाज्मा 1,2,3 में। झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रियाओं में जमावट शुरू करने की प्रक्रिया शामिल है (सबेंडोथेलियम की कोशिका झिल्ली पर, सूजन एंडोथेलियम, या सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर, ऊतक कारक की भागीदारी के साथ), कारकों के मुख्य कैस्केड-सक्रियण की सभी प्रतिक्रियाएं IX, एक्स, प्रोथ्रोम्बिन; थ्रोम्बिन द्वारा कारक ग्यारहवीं की सक्रियता (सक्रिय प्लेटलेट्स, एरिथ्रोसाइट्स, लिपोप्रोटीन और माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली पर); प्रोटीन सी मार्ग की प्रतिक्रियाएं; जमावट एंजाइमों की निष्क्रियता (थ्रोम्बोमोडुलिन कॉफ़ैक्टर्स, एंडोथेलियल प्रोटीन सी रिसेप्टर, हेपरान सल्फेट की भागीदारी के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली पर); और संपर्क मार्ग प्रतिक्रियाएं (प्लेटलेट्स की झिल्ली और अज्ञात कॉफ़ैक्टर्स की भागीदारी के साथ कुछ माइक्रोवेसिकल्स पर)। इस प्रकार, रक्त कोशिकाओं की झिल्ली के साथ विभिन्न प्लाज्मा प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन किए बिना रक्त जमावट की जांच करना असंभव है।
यह पत्र कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स के लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत की विशेषता के लिए एक प्रवाह-साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण शुरू में प्लेटलेट्स और कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ रक्त प्लाज्मा की बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित किया गया था। इसके अलावा, अध्ययन किए गए अधिकांश प्रोटीन नकारात्मक रूप से चार्ज झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स के साथ सीधे बातचीत करते हैं, विशेष रूप से फॉस्फेटिडिलसेरिन 4,5 के साथ। इसके अतिरिक्त, ऐसे प्रोटीन हैं जिनकी झिल्ली के साथ बातचीत विशेष रिसेप्टर्स6 द्वारा मध्यस्थता की जाती है।
प्रवाह साइटोमेट्री की एक महत्वपूर्ण क्षमता अतिरिक्त पृथक्करण के बिना मुक्त और बाध्य लिगेंड के बीच भेदभाव कर रही है। साइटोमेट्री की यह विशेषता समापन बिंदु पर लिगैंड संतुलन बाध्यकारी के अध्ययन की अनुमति देती है और निरंतर गतिज माप करने में मदद करती है। तकनीक अपरिष्कृत है और जटिल नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सक्रिय रूप से फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स, रिसेप्टर्स और जी-प्रोटीन के बीच बातचीत की गतिशीलता का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया जाता है बरकरार और डिटर्जेंट-पारगम्य न्यूट्रोफिल7. यह दृष्टिकोण प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन और वास्तविक समय 8 में एंडोन्यूक्लाइज गतिविधि के कैनेटीक्स की खोज के लिए भी लागूहोता है। समय के साथ, इस पद्धति का उपयोग शुद्ध लिपिड पुटिकाओं9 के साथ उच्च आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए किया गया था, या, अधिक आम तौर पर, झिल्ली प्रोटीन के साथ एक अत्यधिक कुशल एसएफ 9 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली10 में व्यक्त किया गया था। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन-लिपोसोम इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए मात्रात्मक तरीकों का भी वर्णन किया गया है11.
यह तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोतियों का उपयोग करने से बचने के लिए स्व-निर्मित अंशांकन मोतियों का उपयोग करती है7. पहले7 इस्तेमाल किए गए अंशांकन मोती फ्लोरोसिन के साथ काम करने का इरादा रखते थे, जो प्रोटीन पर सुलभ फ्लोरोसेंट लिगेंड के वर्गीकरण को प्रतिबंधित करता था। इसके अलावा, यह पेपर उचित समय रिज़ॉल्यूशन के लिए गतिज डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने का एक नया तरीका प्रदान करता है। यद्यपि इस विधि को कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन एक अलग लिपिड संरचना के साथ कोशिकाओं, प्राकृतिक पुटिकाओं या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के लिए इसकी अनुकूलनक्षमता के लिए कोई स्पष्ट सीमाएं नहीं हैं। यहां वर्णित विधि बातचीत (केऑन, केऑफ) और संतुलन (केडी) के मापदंडों के अनुमान की अनुमति देती है और झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की संख्या के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। ध्यान दें कि यह तकनीक बाध्यकारी साइटों की संख्या का अनुमानित अनुमान प्रदान करती है। विधि के फायदे इसकी सापेक्ष सादगी, पहुंच और देशी कोशिकाओं और प्राकृतिक और कृत्रिम माइक्रोवेसिकल्स के लिए अनुकूलनक्षमता हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

मानव शरीर में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रक्त जमावट में शामिल अधिकांश प्रमुख शारीरिक प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं की झिल्ली पर आगे बढ़ती हैं। किसी भी झिल्ली-निर्भर प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहला कदम फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन का बंधन है। लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विकसित किया गया है। यह विधि जीवित कोशिकाओं और प्राकृतिक या कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं का उपयोग करके प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देती है। इस पद्धति का लाभ अभिकर्मकों और उपकरणों की सादगी और उपलब्धता है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके प्रोटीन को लेबल किया जाता है। हालांकि, स्व-निर्मित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दोनों, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयुग्मन के बाद, प्रोटीन को फॉस्फोलिपिड झिल्ली (माइक्रोवेसिकल्स या कोशिकाओं) के स्रोत के साथ ऊष्मायन किया जाता है, और नमूनों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। प्राप्त डेटा का उपयोग गतिज स्थिरांक और संतुलन की गणना करने के लिए किया जा सकता है कघ। इसके अलावा, विशेष अंशांकन मोतियों का उपयोग करके फॉस्फोलिपिड झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की अनुमानित संख्या का अनुमान लगाना संभव है।

यहां वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग सक्रिय प्लेटलेट्स के लिए प्लाज्मा जमावट प्रोटीन के बंधन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं पीएस: पीसी 20: 80 को मॉडल सिस्ट?...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

यहां, हम कोशिकाओं या माइक्रोवेसिकल्स की झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत को चिह्नित करने के तरीकों के एक सेट का वर्णन करते हैं।

मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके कृत्रिम फॉस्फोलिपिड माइक्रोवेसिकल्स के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण करना

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

इस मात्रा प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग करके शोधकर्ता झिल्ली बातचीत में लाए गए गतिज और संतुलन रीति-रिवाजों की गणना कर सकते हैं और पीपीएच झिल्ली पर साइटों द्वारा लाए गए प्रोटीन की संख्या का अनुमान लगा सकते हैं। इस पद्धति के फायदे अभिकर्मकों और उपकरणों की सादगी और उपलब्धता हैं। यह विधि विशेष रूप से बुनियादी अनुसंधान के लिए है।प्रोटोकॉल रक्त गणना में प्रोटीन लिपिड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, और विभिन्न लिपिड झिल्ली के साथ प्रोटीन की बातचीत को चिह्नित करने के लिए अन्य क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है। विधि का उपयोग विभिन्न कोशिकाओं और लिगैंड प्रकारों पर लिगैंड बाइंडिंग गतिशीलता की मात्रा मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है। टायरोड के बफर में फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं को एक माइक्रोमोलर की एकाग्रता और 250 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में पतला करके गतिज बाध्यकारी प्रयोगों को शुरू करें।फिर फ्लोरोसेंट लेबल जमावट कारक एक्स या एफएक्स एफडी और 500 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के साथ एक से एक अनुपात में 500 नैनोमोलर की एकाग्रता मिलाएं। प्रवाह साइटोमीटर में मिश्रित निलंबन के 500 माइक्रोलीटर तुरंत इंजेक्ट करें। 488 नैनोमीटर की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 585 नैनोमीटर के उत्सर्जन फिल्टर के साथ प्रवाह दर पर; चैनल एफएल दो के लिए 42 की चौड़ाई के साथ।अगला 633 नैनोमीटर पर उत्तेजना के साथ चैनल एफएल चार में औसत प्रतिदीप्ति और 20 की चौड़ाई के साथ 660 नैनोमीटर पर उत्सर्जन फिल्टर को मापें। जब बाध्यकारी की संतृप्ति तेजी से प्राप्त की जाती है तो टाइरोड के बफर के साथ नमूना 20 गुना पतला हो जाता है, और आधारभूत प्रतिदीप्ति, या पठार तक पहुंचने तक पृथक्करण की निगरानी करता है। संतुलन बाध्यकारी प्रयोगों के लिए 20 मिनट के लिए टायरोड के बफर में शून्य से 1000 नैनोमोलर तक एफएक्स एफडी की अलग-अलग सांद्रता के साथ पांच माइक्रोमोलर कृत्रिम फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं को सेते हैं।टायरोड के बफर के साथ 200 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में प्रत्येक नमूने को 20 गुना पतला करने के बाद इनक्यूबेशन के बाद 30 सेकंड के भीतर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पतला नमूना का विश्लेषण करें। डेटा का विश्लेषण करने के लिए, डेटा विश्लेषण के लिए साइटोमीटर सॉफ्टवेयर के लिए साइटोमेट्री डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से एफएससी प्रारूप में प्रयोगों को निर्यात करें। फ़ाइल का चयन करके और फिर निर्यात और FSC फ़ाइलें टैब क्लिक करके।एक बार हो जाने के बाद कंप्यूटर पर फ़ाइलों का चयन करके और फ़ाइलों को प्रोग्राम के कार्यक्षेत्र में खींचकर एफसीएस फ़ाइलों को साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर में खोलें। माइक्रोवेसिकल्स को गेट करने के लिए, लिपोफिलिक डाई, डीआईसी 16 तीन के प्रतिदीप्ति द्वारा माइक्रोवेसिकल्स के क्षेत्र की पहचान करें। फिर लॉग निर्देशांक में एफएल दो डी आई सी 16 से डॉट प्लॉट एसएससी बनाने के लिए वर्कशीट में प्लॉट बटन का उपयोग करें।फिर गेटिंग क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए आयताकार गेट बटन चुनें। गतिज प्रयोगों का विश्लेषण करने के लिए पुटिकाओं के क्षेत्र के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति के निर्देशांक का उपयोग करके एक डॉट प्लॉट बनाएं। अगला, सीएसवी प्रारूप में समय के साथ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर डेटा निर्यात करें; नमूना चुनने के लिए जाकर और निर्यात टैब पर राइट क्लिक करके, इसके बाद पैरामीटर में एफएल चार बार चुनना, चुनिंदा सीएसवी प्रारूप पर क्लिक करने और निर्यात टैब को मारने से पहले बचत के लिए निर्देशिका का चयन करें।स्थानांतरण के बाद, प्रत्येक 1000 घटनाओं के लिए सरल चलती औसत प्रतिदीप्ति और समय की गणना करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में सीएसवी फ़ाइल खोलें घातीय निर्भरता की धारणा के तहत समय पर एकल चलती औसत प्रतिदीप्ति की निर्भरता का एक ग्राफ अनुमानित करें और समीकरण का उपयोग करके गतिज एसोसिएशन स्थिरांक की गणना करने के लिए मूल्य का उपयोग करें। फिर पहले वर्णित समीकरण का उपयोग करके गतिज पृथक्करण स्थिरांक की गणना करें। संतुलन बाध्यकारी परख की तारीख का विश्लेषण करने के लिए, एफएक्स एफडी की प्रत्येक चयनित एकाग्रता के लिए पुटिकाओं के क्षेत्र में एफएक्स एफडी की औसत प्रतिदीप्ति निर्धारित करें और फिर एकल साइट बाध्यकारी की धारणा में जोड़े गए कारक की एकाग्रता से बाध्य कारक प्रतिदीप्ति की निर्भरता का अनुमान लगाएं।कम से कम तीन स्वतंत्र दोहराव से समीकरण का उपयोग करके औसत बाध्यकारी मापदंडों की गणना करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2.5 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड की उपस्थिति में कैल्शियम आईएएनए 4 ए तेईस, एक सौ अस्सी सात के साथ जेल फ़िल्टर्ड प्लेटलेट्स को इनक्यूबेट करके कैलिब्रेटेड मोती तैयार करने के लिए आगे बढ़ें। सक्रिय प्लेटलेट्स एफएक्स एफडी की विभिन्न सांद्रता को जोड़ते हैं और प्लेटलेट्स को दो वॉल्यूम प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड के साथ सेते हैं।एक घंटे के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए तीन दाढ़ ग्लाइसिन और 5% बीएसए के साथ प्लेटलेट्स को इनक्यूबेट करके प्रतिक्रिया को रोकें। फिर पांच मिनट के लिए 400 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ बिना प्रतिक्रिया वाले डाई से मिश्रण को शुद्ध करें। 0.5% बीएसए युक्त टायरोड के बफर में गोली को फिर से निलंबित करने से पहले सुपरनेट निकालें।अगला, स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में अंशांकन मोती के प्रतिदीप्ति स्तर को मापें और फिर प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें। एक सेल काउंटर की मदद से प्रत्येक नमूने में मोतियों की संख्या निर्धारित करें। एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग कर घुलनशील फ्लोरोसेंट डाई की एकाग्रता के लिए प्रत्येक संबंधित मनका नमूने की प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तित करें और स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर अणुओं की संख्या के लिए फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता की पुनर्गणना।प्रत्येक नमूने के लिए फ्लूरोफोर अणुओं की संख्या पर एक प्रवाह साइटोमीटर में मोतियों के औसत प्रतिदीप्ति का निर्भरता ग्राफ बनाएं। फिर विश्लेषण फिटिंग का उपयोग करके लाइन आनुपातिकता द्वारा निर्भरता का अनुमान लगाएं और क्रम में रैखिक टैब फिट करें। समीकरण में सन्निकटन से, बाध्यकारी साइटों के लिए माध्य प्रतिदीप्ति के रूपांतरण कारक की गणना करें।बाद में ब्याज के पुटिका प्रति बाध्यकारी साइटों की स्पष्ट संख्या की गणना करें। प्रतिनिधि विश्लेषण कृत्रिम फॉस्फोर लिपिड पुटिकाओं के गेटिंग को दर्शाता है जो शामिल लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई, डाई आई सी 16 के साथ आकार में एक माइक्रोमीटर हैं, गेट फ्लोरोसेंट डाई के बिना एक ही आकार के कृत्रिम लिपिड पुटिकाओं वाले नमूने के आधार पर सेट किया गया था। पुटिकाओं के लिए बाध्यकारी प्रोटीन के कैनेटीक्स का विश्लेषण पहले चरण में लगातार नमूना एकत्र करके किया गया था।प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्रिक माप समाधान मिश्रण और टायरोड के बफर के साथ पतला करने के बाद जितनी जल्दी हो सके शुरू होना चाहिए। प्रस्तावित विधि को झिल्ली इंटरैक्शन में लाए गए अध्ययन के लिए सतह प्लाज्मा अनुनाद के साथ पूरक किया जा सकता है जो अच्छे अस्थायी संकल्प के साथ अत्यधिक संवेदनशील है और डिलीवरी में लाने की आवश्यकता नहीं है इस विधि का मुख्य लाभ इसकी पहुंच और सादगी है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

संकेतन प्रोटीन के समारोह की नक़ल करना: की ओर कृत्रिम संकेत पारगमन थेरेपी

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

सुमो का स्थानीयकरण-संशोधित फ्लोरोसेंट सूमो-फँसाने प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

पेपर-आधारित प्रीकंसेंट्रेशन और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अलगाव

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा झिल्ली प्रोटीन गुणवत्ता का तेजी से मूल्यांकन

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...