Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Gli autori sono stati supportati da una sovvenzione della Russian Science Foundation 20-74-00133.

1. Etichettatura delle proteine fluorescenti
<ol><li>Preparazione del materiale<ol>
<li>Preparare il tampone di bicarbonato di sodio 1 M, pH 9,0, conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro una settimana.</li>
		<li>Preparare il tampone idrossilammina cloridrato da 1,5 M, pH 8,5, immediatamente prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 10 mg/mL di colorante fluorescente (vedere la Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido. NOTA: questa soluzione può essere conservata per ...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

Il metodo proposto può essere adattato per una caratterizzazione approssimativa dell'interazione delle proteine con membrane fosfolipidiche provenienti da varie fonti e composizioni. La citometria quantitativa a flusso qui descritta concede alla risonanza plasmonica di superficie (SPR) in diversi parametri. In particolare, ha una sensibilità e una risoluzione temporale inferiori e richiede l'etichettatura fluorescente delle proteine. L'etichettatura fluorescente può portare a un cambiamento nella conformazione e alla ...

Le biomembrane separano il contenuto interno delle cellule animali e lo spazio extracellulare. Si noti che le membrane circondano anche le microvescicole formate durante il ciclo di vita della cellula e gli organelli. La membrana cellulare è prevalentemente composta da lipidi e proteine. Le proteine di membrana svolgono funzioni di segnalazione, strutturali, di trasporto e adesive. Tuttavia, il doppio strato lipidico è anche essenziale per l'interrelazione della cellula animale con lo spazio extracellulare. Questo documento propone un metodo per studiare l'interazione periferica delle proteine esterne con la membrana lipidica.
L'esempio più eclatante di reazioni che si verificano sullo strato esterno della membrana di una cellula animale è la reazione di coagulazione del sangue. Una caratteristica importante della coagulazione del sangue è che tutte le principali reazioni procedono sulle membrane fosfolipidiche delle cellule e delle microvescicole derivanti da queste cellule e non nel plasma 1,2,3. Le reazioni dipendenti dalla membrana includono il processo di coagulazione iniziale (sulle membrane cellulari del subendotelio, dell'endotelio infiammato o delle cellule immunitarie attivate, con la partecipazione di un fattore tissutale), tutte le reazioni della principale attivazione a cascata dei fattori IX, X, protrombina; attivazione del fattore XI da parte della trombina (sulle membrane di piastrine attivate, eritrociti, lipoproteine e microvescicole); reazioni della via della proteina C; inattivazione degli enzimi della coagulazione (sulle membrane delle cellule endoteliali con la partecipazione di cofattori di trombomodulina, recettore C della proteina endoteliale, eparan solfato); e reazioni alle vie di contatto (su membrane di piastrine e alcune microvescicole con la partecipazione di cofattori sconosciuti). Pertanto, è impossibile indagare sulla coagulazione del sangue senza studiare l'interazione di varie proteine plasmatiche con la membrana delle cellule del sangue.
Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per caratterizzare l'interazione delle proteine con le membrane lipidiche delle cellule o delle microvescicole. Questo approccio è stato inizialmente proposto per studiare l'interazione del plasma sanguigno con piastrine e vescicole fosfolipidiche artificiali. Inoltre, la maggior parte delle proteine studiate interagisce direttamente con i fosfolipidi di membrana caricati negativamente, in particolare con la fosfatidilserina 4,5. Inoltre, ci sono proteine la cui interazione con la membrana è mediata da speciali recettori6.
Un'importante capacità della citometria a flusso è la discriminazione tra ligandi liberi e legati senza separazione aggiuntiva. Questa caratteristica della citometria consente lo studio del legame di equilibrio del ligando all'endpoint e aiuta a eseguire misurazioni cinetiche continue. La tecnica non è sofisticata e non richiede una preparazione complessa del campione. La citometria a flusso viene utilizzata attivamente per studiare quantitativamente la dinamica di interazione tra peptidi fluorescenti, recettori e proteine G in neutrofili intatti e permeabili ai detergenti7. Questo approccio è applicabile anche per esplorare le interazioni proteina-DNA e la cinetica dell'attività dell'endonucleasi in tempo reale8. Nel corso del tempo, questo metodo è stato utilizzato per studiare quantitativamente le interazioni proteina-proteina ad alta affinità con le vescicole lipidiche purificate9 o, più in generale, con le proteine di membrana espresse in un sistema di espressione cellulare Sf9 altamente efficiente10. Sono stati descritti anche metodi quantitativi per caratterizzare le interazioni proteina-liposoma utilizzando la citometria a flusso per le proteine transmembrana11.
Questa tecnica utilizza perline di calibrazione autoprodotte per evitare l'uso di perline7 disponibili in commercio. Le perle di calibrazione utilizzate in precedenza7 erano destinate a funzionare con la fluoresceina, che limitava sostanzialmente l'assortimento di ligandi fluorescenti accessibili sulle proteine. Inoltre, questo documento offre un nuovo modo per acquisire e analizzare i dati cinetici per una risoluzione temporale ragionevole. Sebbene questo metodo sia descritto per le vescicole fosfolipidiche artificiali, non ci sono limitazioni evidenti per la sua adattabilità a cellule, vescicole naturali o vescicole fosfolipidiche artificiali con una diversa composizione lipidica. Il metodo qui descritto consente la stima dei parametri di interazione (kon, koff) ed equilibrio (Kd) e facilita la caratterizzazione quantitativa del numero di siti di legame proteico sulla membrana. Si noti che questa tecnica fornisce una stima approssimativa del numero di siti di associazione. I vantaggi del metodo sono la sua relativa semplicità, accessibilità e adattabilità alle cellule native e alle microvescicole naturali e artificiali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

Nel corpo umano, la maggior parte delle principali reazioni fisiologiche coinvolte nella risposta immunitaria e nella coagulazione del sangue procedono sulle membrane delle cellule. Un primo passo importante in qualsiasi reazione dipendente dalla membrana è il legame delle proteine sulla membrana fosfolipidica. Un approccio allo studio dell'interazione proteica con le membrane lipidiche è stato sviluppato utilizzando proteine marcate fluorescentemente e citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio delle interazioni proteina-membrana utilizzando cellule vive e vescicole fosfolipidiche naturali o artificiali. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. In questo metodo, le proteine sono etichettate utilizzando coloranti fluorescenti. Tuttavia, possono essere utilizzate sia proteine autoprodotte che disponibili in commercio, etichettate in modo fluorescente. Dopo la coniugazione con un colorante fluorescente, le proteine vengono incubate con una fonte della membrana fosfolipidica (microvescicole o cellule) e i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso. I dati ottenuti possono essere utilizzati per calcolare le costanti cinetiche e l'equilibrio Kd. Inoltre, è possibile stimare il numero approssimativo di siti di legame proteico sulla membrana fosfolipidica utilizzando speciali perle di calibrazione.

Il metodo di citometria a flusso qui descritto viene utilizzato per caratterizzare il legame delle proteine della coagulazione plasmatica alle piastrine attivate. Inoltre, le vescicole di fosfolipidi PS:PC 20:80 sono state applicate come sistema modello. Questo documento si concentra principalmente sulle vescicole fosfolipidiche artificiali come esempio. I parametri del citometro, in particolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e la compensazione devono essere selezionati per ogni dispositivo specifico, l'og...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Utilizzando questo metodo di citometria a flusso quantitativo, i ricercatori possono calcolare le abitudini cinetiche e di equilibrio dell'interazione di membrana introdotta e stimare il numero di proteine introdotte dai siti sulla membrana PPH. I vantaggi di questo metodo sono la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. Questo metodo è esclusivamente per la ricerca di base.Il protocollo è stato sviluppato per studiare le interazioni lipidiche proteiche nel calcolo del sangue e può essere utilizzato in altre aree per caratterizzare l'interazione delle proteine con varie membrane lipidiche. Il metodo può essere utilizzato per la valutazione quantitativa delle dinamiche di legame del ligando sulle varie cellule e tipi di ligando. Inizia gli esperimenti di legame cinetico diluendo le vescicole fosfolipidiche nel tampone di Tyrode a una concentrazione di un micromolare e un volume totale di 250 microlitri.Quindi mescolare il fattore X della coagulazione marcato fluorescente o FX FD e una concentrazione di 500 nanomolari con le vescicole fosfolipidiche in un rapporto uno a uno per ottenere un volume totale di 500 microlitri. Iniettare immediatamente 500 microlitri della sospensione mista nel citometro a flusso. Ad una portata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e un filtro di emissione di 585 nanometri; con una larghezza di 42 per il canale FL due.Successivamente misurare la fluorescenza media nel canale FL quattro con eccitazione a 633 nanometri e filtro di emissione a 660 nanometri con una larghezza di 20. Quando si raggiunge la saturazione del legame, diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino a raggiungere una fluorescenza basale o un plateau. Per esperimenti di legame all'equilibrio incubare cinque vescicole artificiali di fosfolipidi artificiali micromolari con concentrazioni variabili di FX FD da zero a 1000 nanomolari nel tampone di Tyrode per 20 minuti.Dopo l'incubazione diluire ogni campione di 20 volte a un volume finale di 200 microlitri con il tampone di Tyrode, quindi analizzare il campione diluito mediante citometria a flusso entro 30 secondi. Per analizzare i dati, esportare gli esperimenti in formato FSC dal software di acquisizione dati di citometria al software di citometro per l'analisi dei dati. Scegliendo il file e quindi facendo clic sulle schede Esporta e File FSC.una volta fatto aprire i file FCS nel software cytometer selezionando i file sul computer e trascinando i file nell'area di lavoro del programma. Per gating le microvescicole, identificare la regione delle microvescicole mediante fluorescenza del colorante lipofilo, DIC 16 tre. Quindi utilizzare il pulsante di stampa nel foglio di lavoro per creare un SSC dot plot da FL due D I C 16 in coordinate di registro.Quindi scegli il pulsante del cancello rettangolare per disegnare una regione di gating. Per analizzare gli esperimenti cinetici creare un dot plot utilizzando le coordinate di fluorescenza nel tempo per la regione delle vescicole. Successivamente, esporta i dati sulla variazione della fluorescenza nel tempo nel formato CSV; andando a scegliere il campione e facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda di esportazione, seguito dalla scelta di FL quattro volte nei parametri, seleziona la directory per il salvataggio prima di fare clic su seleziona formato CSV e premere la scheda di esportazione.Dopo il trasferimento, aprire il file CSV nel software statistico per calcolare la semplice fluorescenza della media mobile e il tempo per ogni 1000 eventi approssimare un grafico della dipendenza della singola fluorescenza della media mobile sul tempo sotto l'ipotesi della dipendenza esponenziale e utilizzare il valore per calcolare la costante di associazione cinetica utilizzando un'equazione. Quindi calcolare la costante di dissociazione cinetica utilizzando l'equazione come descritto in precedenza. Per analizzare la data del test di legame di equilibrio, determinare la fluorescenza media di FX FD nella regione delle vescicole per ogni concentrazione selezionata di FX FD e quindi approssimare la dipendenza della fluorescenza del fattore legato dalla concentrazione del fattore aggiunto nell'ipotesi del legame a sito singolo.Calcola i parametri di legame medi utilizzando un'equazione da tre ripetizioni indipendenti come minimo. Procedere alla preparazione di perline calibrate incubando piastrine filtrate in gel con calcio IANA 4A ventitré, centottantasette in presenza di cloruro di calcio millimolare 2,5 millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Le piastrine attivate aggiungono le varie concentrazioni di FX FD e incubano le piastrine con il due percento di formaldeide in volume.Dopo un'ora, interrompere la reazione incubando le piastrine con tre glicina molare e 5% BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi purificare la miscela dal colorante non reagito con centrifugazione a 400 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernato prima di riutilizzare il pellet nel tampone di Tyrode contenente lo 0,5% di BSA.Quindi, misurare il livello di fluorescenza delle perle di calibrazione in ciascun campione utilizzando uno spettrofluorometro e quindi utilizzando il citometro a flusso. Determinare il numero di perline in ciascun campione con l'aiuto di un contatore di celle. Convertire l'intensità di fluorescenza di ciascun rispettivo campione di perline nella concentrazione di colorante fluorescente solubile utilizzando uno spettrofluorometro e ricalcolare la concentrazione di colorante fluorescente per il numero di molecole dello spettrofluorometro.Creare un grafico di dipendenza della fluorescenza media delle perline in un citometro a flusso sul numero di molecole di fluroforo per ciascun campione. Quindi approssimare la dipendenza in base alla proporzionalità della linea utilizzando il raccordo di analisi e adattare le linguette lineari in ordine. Dall'approssimazione nell'equazione, calcolare il fattore di conversione della fluorescenza media ai siti di legame.Successivamente calcolare il numero apparente dei siti di legame per vescicola di interesse. L'analisi rappresentativa mostra il gating delle vescicole lipidiche artificiali al fosforo che hanno una dimensione di un micrometro con il colorante fluorescente lipofilo incorporato, colorante I C 16, il gate è stato impostato sulla base di un campione contenente vescicole lipidiche artificiali della stessa dimensione senza il colorante fluorescente. La cinetica del legame proteico alle vescicole è stata analizzata nella prima fase raccogliendo il campione in modo continuo.I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando la citometria a flusso. Le misurazioni citometriche a flusso dovrebbero iniziare il prima possibile dopo aver miscelato le soluzioni e diluito con il tampone di Tyrode. Il metodo proposto potrebbe essere integrato con la risonanza plasmatica di superficie per lo studio delle interazioni di membrana che è altamente sensibile con una buona risoluzione temporanea e non richiede la consegna portata Il principale vantaggio di questo metodo è la sua accessibilità e semplicità.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Ricerca

Biochimica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...