Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

著者らは、ロシア科学財団の助成金20-74-00133によって支援されました。

1. 蛍光タンパク質標識
<ol><li>材料準備<ol>
<li>1 M 炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 9.0 を用意し、4 °Cで保存し、1 週間以内に使用してください。</li>
		<li>使用直前に1.5 Mヒドロキシルアミン塩酸塩緩衝液(pH 8.5)を調製する。</li>
		<li>ジメチルスルホキシド中の蛍光色素( 材料表参照)の10mg/mL溶液を調製する。 注:この溶液は、暗闇の中で-20°Cで1ヶ月間保存することがで?...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

提案された方法は、様々な供給源および組成物からのタンパク質とリン脂質膜との相互作用の大まかな特徴付けに適合させることができる。ここで説明する定量的フローサイトメトリーは、いくつかのパラメータで表面プラズモン共鳴(SPR)を認めています。特に、感度と時間分解能が低く、タンパク質の蛍光標識が必要です。蛍光標識は、多くのタンパク質の立体構造の変化および活性の喪?...

生体膜は、動物細胞の内部内容物と細胞外空間を分離する。膜はまた、細胞のライフサイクルおよび細胞小器官の間に形成された微小小胞を囲むことに留意されたい。細胞膜は、主に脂質およびタンパク質からなる。膜タンパク質は、シグナル伝達、構造的、輸送的、および接着機能を実行する。しかしながら、脂質二重層は、動物細胞と細胞外空間との相互関係にも必須である。本稿では、外部タンパク質と脂質膜との末梢相互作用を研究する方法を提案する。
動物細胞の外膜層で起こる反応の最も顕著な例は、血液凝固反応である。血液凝固の重要な特徴は、すべての主要な反応が、血漿中ではなく、これらの細胞から生じる細胞および微小小胞のリン脂質膜上で進行することである1,2,3。膜依存性反応には、凝固を開始するプロセス(組織因子の関与を伴う内皮下、炎症を起こした内皮、または活性化免疫細胞の細胞膜上)、因子IX、X、プロトロンビンの主なカスケード活性化のすべての反応が含まれる。トロンビンによる第XI因子の活性化(活性化血小板、赤血球、リポタンパク質、および微小小胞の膜上);プロテインC経路の反応;凝固酵素の不活性化(トロンボモジュリン補因子、内皮タンパク質C受容体、ヘパラン硫酸の関与を伴う内皮細胞の膜上);接触経路反応(未知の補因子の関与を伴う血小板およびいくつかの微小小胞の膜上)。したがって、様々な血漿タンパク質と血球の膜との相互作用を研究することなしに血液凝固を調べることは不可能である。
この論文では、タンパク質と細胞または微小小胞の脂質膜との相互作用を特徴付けるためのフローサイトメトリーベースの方法について説明します。このアプローチは、血漿と血小板および人工リン脂質小胞との相互作用を研究するために最初に提案された。さらに、研究されたタンパク質のほとんどは、負に荷電した膜リン脂質、特にホスファチジルセリン4,5と直接相互作用する。さらに、膜との相互作用が特別な受容体6によって媒介されるタンパク質がある。
フローサイトメトリーの重要な能力は、追加の分離なしに遊離リガンドと結合リガンドを区別することです。サイトメトリーのこの特徴は、エンドポイントにおけるリガンド平衡結合の研究を可能にし、連続的な動態測定の実行に役立ちます。この技術は洗練されておらず、複雑なサンプル調製を必要としません。フローサイトメトリーは、インタクトで洗剤透過性の好中球における蛍光ペプチド、受容体、およびGタンパク質間の相互作用のダイナミクスを定量的に研究するために積極的に使用されている7。このアプローチは、タンパク質-DNA相互作用およびエンドヌクレアーゼ活性の動態をリアルタイムで探索するためにも適用可能である8。時間が経つにつれて、この方法は、精製脂質小胞9との高親和性タンパク質間相互作用、またはより一般的には、高効率Sf9細胞発現系10において発現される膜タンパク質との高親和性タンパク質間相互作用を定量的に研究するために使用された。膜貫通タンパク質11に対するフローサイトメトリーを用いてタンパク質−リポソーム相互作用を特徴付けるための定量的方法も記載されている。
この技術は、市販のビーズ7の使用を避けるために、自作の較正ビーズを使用する。以前に使用した較正ビーズ7 はフルオレセインと連携することを意図しており、タンパク質上のアクセス可能な蛍光リガンドの品揃えを実質的に制限していました。さらに、このホワイトペーパーでは、合理的な時間分解能を得るためにキネティックデータを取得および分析する新しい方法を提供します。この方法は人工リン脂質小胞について記載されているが、細胞、天然小胞、または異なる脂質組成を有する人工リン脂質小胞に対するその適応性について明らかな制限はない。本明細書に記載される方法は、相互作用(kon、koff)および平衡(Kd)のパラメータの推定を可能にし、膜上のタンパク質結合部位の数の定量的特徴付けを容易にする。この手法は、結合部位の数のおおよその推定値を提供することに注意してください。この方法の利点は、その相対的な単純さ、アクセシビリティ、および天然細胞および天然および人工微小小胞への適応性である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

人体では、免疫反応や血液凝固に関わる主要な生理反応のほとんどが細胞の膜上で進行します。任意の膜依存性反応における重要な第1段階は、リン脂質膜上のタンパク質の結合である。タンパク質と脂質膜との相互作用を研究するアプローチは、蛍光標識タンパク質およびフローサイトメトリーを用いて開発されている。この方法は、生細胞および天然または人工リン脂質小胞を用いたタンパク質膜相互作用の研究を可能にする。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法では、蛍光色素を用いてタンパク質を標識する。しかしながら、自作および市販の両方の、蛍光標識タンパク質が使用可能である。蛍光色素とのコンジュゲーション後、タンパク質をリン脂質膜の供給源(微小小胞または細胞)と共にインキュベートし、サンプルをフローサイトメトリーによって分析する。得られたデータは、動力学定数および平衡Kdを計算するために使用することができる。さらに、特別な較正ビーズを用いてリン脂質膜上のタンパク質結合部位のおおよその数を推定することができる。

本明細書に記載のフローサイトメトリー法は、活性化血小板への血漿凝固タンパク質の結合を特徴付けるために使用される。また、リン脂質小胞PS:PC 20:80をモデル系として適用した。本稿では、主に人工リン脂質小胞を例に挙げる。サイトメーターのパラメータ、特に、光電子増倍管(PMT)電圧および補償は、特定の装置、研究対象(細胞、人工または天然の微小小胞)、および使用される色素ご?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

ここでは、タンパク質と細胞または微小小胞の膜との相互作用を特徴付けるための一連の方法について説明する。

蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

この量のフローサイトメトリー法を用いて、研究者は膜相互作用を持ち込まれた動態的および平衡習慣を計算し、PPH膜上の部位によってもたらされたタンパク質の数を推定することができる。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法は、基礎研究専用です。このプロトコルは、血液計算におけるタンパク質脂質相互作用を研究するために開発され、タンパク質と様々な脂質膜との相互作用を特徴付けるために他の分野で使用することができる。この方法は、様々な細胞およびリガンドタイプ上のリガンド結合ダイナミクスの量評価に使用することができる。タイロード緩衝液中のリン脂質小胞を1マイクロモルの濃度および250マイクロリットルの総量に希釈することによって、動態結合実験を開始する。次いで、蛍光標識凝固第X因子またはFX FDと500ナノモルの濃度とリン脂質小胞とを1対1の比率で混合し、500マイクロリットルの総体積を得る。直ちに500マイクロリットルの混合懸濁液をフローサイトメーターに注入する。励起波長が488ナノメートル、発光フィルターが585ナノメートルの流量で、チャネルFL2の幅は42です。次に、チャネルFL4の平均蛍光を633ナノメートルの励起で測定し、発光フィルターを660ナノメートルで幅20で測定する。結合の飽和が達成されたら、試料をタイロード緩衝液で20倍に急速に希釈し、ベースライン蛍光またはプラトーに達するまで解離をモニターする。平衡結合実験のために、0から1000ナノモルまでのFX FDの様々な濃度を有する5マイクロモルの人工リン脂質小胞を、タイロードの緩衝液中で20分間インキュベートする。インキュベーション後、各サンプルをタイロード緩衝液で最終容量200マイクロリットルまで20倍希釈し、希釈サンプルを30秒以内にフローサイトメトリーで分析します。データを分析するには、実験をFSC形式でサイトメトリーデータ収集ソフトウェアからサイトメーターソフトウェアにエクスポートしてデータ分析します。ファイルを選択し、[エクスポート]タブと[FSCファイル]タブをクリックします。完了したら、コンピュータ上のファイルを選択し、ファイルをプログラムのワークスペースにドラッグして、FCSファイルをサイトメーターソフトウェアに開きます。マイクロベシクルをゲーティングするため、親油性色素、DIC163の蛍光によりマイクロベシクルの領域を特定する。次に、ワークシートのプロットボタンを使用して、対数座標でFL 2つのD I C 16からドットプロットSSCを作成します。次に、長方形のゲートボタンを選択してゲート領域を描画します。運動学的実験を分析するために、小胞の領域についての経時的な蛍光の座標を使用してドットプロットを作成する。次に、時間の経過に伴う蛍光の変化に関するデータをCSV形式でエクスポートします;サンプルを選択してエクスポートタブを右クリックし、次にパラメータでFL 4時間を選択し、CSV形式を選択してエクスポートタブを押す前に保存するディレクトリを選択します。転送後、統計ソフトでCSVファイルを開き、単純移動平均蛍光を算出し、指数依存性の仮定下での時間に対する単一移動平均蛍光の依存性のグラフを近似する1000イベント毎に時間、その値を用いて、式を用いて動態会合定数を算出する。次に、前述の式を使用して動力解離定数を計算します。平衡結合アッセイの日付を分析するには、FX FDの各選択された濃度について小胞の領域におけるFX FDの平均蛍光を決定し、次いで、単一部位結合の仮定において添加された因子の濃度から結合因子蛍光の依存性を近似する。平均結合パラメータは、少なくとも3つの独立した繰り返しからの式を使用して計算します。ゲル濾過血小板をカルシウムIANA 4A 23、187と共に2.5ミリモル塩化カルシウムの存在下で室温で10分間インキュベートすることによって較正ビーズの調製を進める。活性化血小板に様々な濃度のFX FDを加え、血小板を2容量パーセントのホルムアルデヒドでインキュベートします。1時間後、血小板を3モルのグリシンおよび5%BSAと共に室温で30分間インキュベートすることによって反応を停止させる。次いで、未反応染料から混合物を400倍Gで5分間遠心分離して精製する。0.5%BSAを含むTyrodeの緩衝液にペレットを再懸濁する前に、上着液を除去してください。次に、分光蛍光計を用いて各試料中の較正ビーズの蛍光レベルを測定し、次いでフローサイトメーターを用いて測定する。セルカウンターの助けを借りて、各サンプル中のビーズの数を決定します。分光蛍光光度計を用いて各ビーズ試料の蛍光強度を可溶性蛍光色素の濃度に変換し、分光蛍光光度計分子数に対する蛍光色素濃度を再計算する。各サンプルのフルロフォア分子の数に対するフローサイトメーター内のビーズの平均蛍光の依存性グラフを作成します。次に、解析フィッティングを使用して線比例によって依存関係を近似し、線形タブを順番に適合します。式中の近似から、結合部位に対する平均蛍光の変換係数を計算する。後で目的の小胞あたりの結合部位の見かけ数を計算する。代表的な分析は、組み込まれた親油性蛍光色素、色素IC16を有する1マイクロメートルのサイズである人工蛍光体脂質小胞のゲーティングを示し、ゲート蛍光色素を含まない同じサイズの人工脂質小胞を含む試料に基づいて設定した。小胞に結合するタンパク質の動態を、試料を連続的に採取することによって第1段階で分析した。得られたデータをフローサイトメトリーを用いて分析した。フローサイトメトリー測定は、溶液を混合し、タイロードの緩衝液で希釈した後、できるだけ早く開始する必要があります。提案された方法は、良好な一時的な分解能で高感度であり、送達をもたらす必要がない膜相互作用をもたらした研究のための表面血漿共鳴で補完することができるこの方法の主な利点は、そのアクセシビリティおよび単純さである。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...