Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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저자는 러시아 과학 재단 보조금 20-74-00133의 지원을 받았다.

1. 형광 단백질 표지
<ol><li>재료 준비<ol>
<li>1 M 중탄산나트륨 완충액, pH 9.0을 준비하고 4°C에서 보관하고 1주일 이내에 사용한다.</li>
		<li>사용 직전에 1.5 M 하이드록실아민 염산염 완충액, pH 8.5를 준비하십시오.</li>
		<li>디메틸설폭사이드에 형광염료 10mg/mL 용액( 물질표 참조)을 준비한다. 참고 :이 용액은 어둠 속에서 -20 ° C에서 한 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

제안된 방법은 다양한 공급원 및 조성물로부터의 단백질과 인지질 막의 상호작용의 대략적인 특성화를 위해 적응될 수 있다. 여기에 설명된 정량적 유세포 분석기는 몇 가지 파라미터에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 인정합니다. 특히, 낮은 감도 및 시간 분해능을 가지며 단백질의 형광 표지가 필요하다. 형광 표지는 많은 단백질에 대한 입체 형태의 변화 및 활성의 손실을 초래할 수 있으므로 신?...

생물막은 동물 세포와 세포외 공간의 내부 내용물을 분리합니다. 막은 또한 세포의 수명주기와 소기관 동안 형성된 마이크로베시클을 둘러싸고 있습니다. 세포막은 주로 지질과 단백질로 구성되어 있습니다. 막 단백질은 신호전달, 구조, 수송 및 접착 기능을 수행합니다. 그러나, 지질 이중층은 또한 동물 세포와 세포외 공간의 상호관계에 필수적이다. 이 논문은 외부 단백질과 지질막의 말초 상호작용을 연구하는 방법을 제안한다.
동물 세포의 외막층에서 일어나는 반응의 가장 두드러진 예는 혈액 응고 반응이다. 혈액 응고의 중요한 특징은 모든 주요 반응이 혈장 1,2,3이 아닌 이들 세포로부터 발생하는 세포 및 마이크로베시클의 인지질 막에서 진행된다는 것입니다. 막-의존성 반응은 (조직 인자의 참여와 함께 침강하피, 염증 내피, 또는 활성화된 면역 세포의 세포막 상에서) 응고를 시작하는 과정을 포함하며, 주요 캐스케이드의 모든 반응-인자 IX, X, 프로트롬빈의 활성화; 트롬빈에 의한 인자 XI의 활성화 (활성화된 혈소판, 적혈구, 지단백질 및 마이크로베시클의 막상); 단백질 C 경로의 반응; 응고 효소의 불활성화 (트롬보모듈린 보조인자, 내피 단백질 C 수용체, 헤파란 설페이트의 참여와 함께 내피 세포의 막에); 및 접촉 경로 반응 (혈소판의 막과 알려지지 않은 보조 인자의 참여가있는 일부 미생물에). 따라서, 다양한 혈장 단백질과 혈액 세포의 막의 상호작용을 연구하지 않고서는 혈액 응고를 조사하는 것은 불가능하다.
이 논문은 세포 또는 마이크로베시클의 지질막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 유동-세포측정-기반 방법을 기술한다. 이 접근법은 혈소판 및 인공 인지질 소포와 혈장의 상호 작용을 연구하기 위해 처음에 제안되었다. 더욱이, 연구된 대부분의 단백질은 음전하를 띤 막 인지질, 특히 포스파티딜세린 4,5와 직접 상호작용한다. 추가적으로, 막과의 상호작용이 특별한 수용체6에 의해 매개되는 단백질이 있다.
유세포 분석의 중요한 능력은 추가적인 분리 없이 자유 리간드와 결합된 리간드를 구별하는 것이다. 세포측정의 이러한 특징은 종점에서 리간드 평형 결합에 대한 연구를 허용하고 지속적인 동역학적 측정을 수행하는 데 도움이 된다. 이 기술은 정교하지 않으며 복잡한 샘플 준비가 필요하지 않습니다. 유세포 분석기는 무손상 및 세제-투과성 호중구7에서 형광 펩티드, 수용체 및 G-단백질 사이의 상호작용의 역학을 정량적으로 연구하기 위해 활발히 사용된다. 이 접근법은 단백질-DNA 상호작용 및 엔도뉴클레아제 활성의 동역학을 실시간으로 탐구하는 데에도 적용 가능하다8. 시간이 지남에 따라, 이 방법은 정제된 지질 소포(9)와의 고친화성 단백질-단백질 상호작용, 또는 보다 일반적으로는 고효율Sf9 세포 발현 시스템(10)에서 발현되는 막 단백질과의 상호작용을 정량적으로 연구하는데 사용되었다. 막횡단 단백질(11)에 대한 유세포 분석기를 이용한 단백질-리포좀 상호작용을 특성화하기 위한 정량적 방법도 기술되었다.
이 기술은 상업적으로 이용가능한 비드(7)를 사용하지 않기 위해 자체 제작된 교정 비드를 사용한다. 이전에7 번 사용된 교정 비드는 플루오레세인과 함께 작동하도록 의도되었으며, 이는 단백질 상의 접근 가능한 형광 리간드의 구색을 실질적으로 제한하였다. 또한이 백서에서는 합리적인 시간 해결을 위해 운동 데이터를 수집하고 분석하는 새로운 방법을 제공합니다. 이 방법이 인공 인지질 소포에 대해 기술되어 있지만, 다른 지질 조성을 갖는 세포, 천연 소포 또는 인공 인지질 소포에 대한 그의 적응성에 대한 명백한 제한은 없다. 본원에 기재된 방법은 상호작용 파라미터 (kon,koff) 및 평형 (Kd)의 추정을 허용하고, 막 상의 단백질 결합 부위의 수의 정량적 특성화를 용이하게 한다. 이 기술은 결합 부위의 수에 대한 대략적인 추정치를 제공한다는 점에 유의한다. 이 방법의 장점은 천연 세포와 천연 및 인공 미생물에 대한 상대적 단순성, 접근성 및 적응성입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

인체에서 면역 반응 및 혈액 응고에 관여하는 대부분의 주요 생리 반응은 세포막에서 진행됩니다. 임의의 막 의존성 반응에서 중요한 첫 번째 단계는 인지질 막에 단백질의 결합이다. 지질막과의 단백질 상호작용을 연구하는 접근법은 형광 표지된 단백질과 유세포 분석기를 사용하여 개발되었다. 이 방법은 살아있는 세포와 천연 또는 인공 인지질 소포를 이용한 단백질-막 상호작용의 연구를 허용한다. 이 방법의 장점은 시약 및 장비의 단순성과 가용성입니다. 이 방법에서, 단백질은 형광 염료를 사용하여 표지된다. 그러나, 자가제조 및 상업적으로 입수가능한, 형광 표지된 단백질 둘 모두가 사용될 수 있다. 형광 염료와 컨쥬게이션 한 후, 단백질은 인지질 막 (마이크로베시클 또는 세포)의 공급원과 함께 인큐베이션되고, 샘플은 유세포 분석기에 의해 분석된다. 획득된 데이터는 운동 상수 및 평형Kd를 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 특수 교정 비드를 사용하여 인지질 막 상의 단백질 결합 부위의 대략적인 수를 추정할 수 있다.

본원에 기재된 유세포 분석 방법은 활성화된 혈소판에 대한 혈장 응고 단백질의 결합을 특성화하기 위해 사용된다. 또한, 인지질 소포 PS:PC 20:80을 모델 시스템으로 적용하였다. 이 논문은 주로 인공 인지질 소포를 예로 들어 초점을 맞춥니다. 세포계의 파라미터, 특히, 광승수 튜브 (PMT) 전압 및 보상은 각각의 특정 장치, 연구 목적 (세포, 인공 또는 천연 마이크로베시클) 및 사용된 염료에 대해 선?...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

이 양의 유세포 분석기 방법을 사용하여 연구자들은 막 상호 작용에 가져온 운동 및 평형 관습을 계산하고 PPH 막의 부위에 의해 가져온 단백질의 수를 추정 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 시약 및 장비의 단순성과 가용성입니다. 이 방법은 기본 연구를위한 것입니다.이 프로토콜은 혈액 계산에서 단백질 지질 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었으며 다양한 지질 막과 단백질의 상호 작용을 특성화하기 위해 다른 영역에서 사용될 수 있습니다. 상기 방법은 다양한 세포 및 리간드 유형에 대한 리간드 결합 역학의 수량 평가를 위해 사용될 수 있다. Tyrode's 완충액에 있는 인지질 소포를 하나의 마이크로몰 농도 및 250 마이크로리터의 총 부피로 희석하여 동역학적 결합 실험을 시작하십시오.그 다음 형광 표지된 응고 인자 X 또는 FX FD와 500 나노몰의 농도를 인지질 소포와 일대일 비율로 혼합하여 총 부피 500 마이크로리터를 얻었다. 즉시 500 마이크로리터의 혼합 현탁액을 유세포 분석기에 주입한다. 여기 파장이 488 나노 미터이고 방출 필터가 585 나노 미터인 유속에서, 채널 FL 2의 경우 너비가 42입니다.다음으로 633 나노미터에서 여기하고 20의 폭을 갖는 660 나노미터에서 방출 필터로 채널 FL 4에서 평균 형광을 측정한다. 결합의 포화가 달성되면 샘플을 Tyrode's 버퍼로 20배 빠르게 희석하고, 기준선 형광 또는 고원에 도달할 때까지 해리를 모니터링한다. 평형 결합 실험을 위해 20분 동안 티로데의 완충액에서 0에서 1000나노몰까지 FX FD의 다양한 농도를 갖는 다섯 마이크로몰 인공 인지질 소포를 인큐베이션한다.인큐베이션 후 각 샘플을 Tyrode's 완충액으로 최종 부피 200 마이크로리터로 20배 희석한 다음, 희석된 샘플을 30초 이내에 유세포 분석기로 분석한다. 데이터를 분석하려면 FSC 형식의 실험을 세포측정 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 분석을 위한 세포계 소프트웨어로 내보냅니다. 파일을 선택한 다음 내보내기 및 FSC 파일 탭을 클릭합니다.완료되면 컴퓨터에서 파일을 선택하고 파일을 프로그램의 작업 공간으로 드래그하여 FCS 파일을 세포계 소프트웨어로 엽니 다. 마이크로베시클을 게이팅하기 위해, 친유성 염료인 DIC 16 three의 형광에 의해 마이크로베시클의 영역을 확인한다. 그런 다음 워크시트의 플롯 단추를 사용하여 로그 좌표에 FL 두 D I C 16에서 점도표 SSC를 만듭니다.그런 다음 직사각형 게이트 버튼을 선택하여 게이팅 영역을 그립니다. 동역학 실험을 분석하기 위해 소포의 영역에 대한 시간에 따른 형광의 좌표를 이용하여 점도표를 작성한다. 그런 다음 시간이 지남에 따라 형광 변화에 대한 데이터를 CSV 형식으로 내보내고 샘플을 선택하고 내보내기 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 매개 변수에서 FL을 네 번 선택한 다음 저장할 디렉토리를 선택한 다음 CSV 형식 선택을 클릭하고 내보내기 탭을 누르십시오.전송 후 통계 소프트웨어에서 CSV 파일을 열어 1000개의 이벤트마다 간단한 이동 평균 형광 및 시간을 계산하여 지수 의존성을 가정하여 시간에 대한 단일 이동 평균 형광의 의존성 그래프를 근사화하고 이 값을 사용하여 방정식을 사용하여 운동 연관 상수를 계산합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 방정식을 사용하여 운동 해리 상수를 계산하십시오. 평형 결합 분석의 날짜를 분석하기 위해, FX FD의 선택된 각 농도에 대한 소포의 영역에서 FX FD의 평균 형광을 결정한 다음, 단일 부위 결합의 가정하에 첨가된 인자의 농도로부터 결합된 인자 형광의 의존성을 근사화한다.최소한 세 개의 독립적인 반복으로부터 방정식을 사용하여 평균 결합 파라미터를 계산한다. 겔 여과된 혈소판을 실온에서 10분 동안 2.5 밀리몰 염화칼슘의 존재 하에 이십삼, 백팔십칠칼슘으로 인큐베이션하여 보정된 비드의 제조를 진행한다. 활성화된 혈소판이 FX FD의 다양한 농도를 첨가하고 혈소판을 두 부피 퍼센트 포름알데히드로 인큐베이션한다.한 시간 후, 실온에서 30분 동안 3개의 몰 글리신 및 5%BSA로 혈소판을 인큐베이션함으로써 반응을 중지시킨다. 그 후 미반응 염료로부터 혼합물을 5분 동안 400배 G에서 원심분리하여 정제한다. 펠렛을 0.5%BSA를 함유하는 Tyrode's 완충액에 재현탁시키기 전에 상퍼네이트를 제거한다.다음으로, 분광형광계를 이용하여 각 시료에서 교정 비드의 형광 수준을 측정한 다음, 유세포 분석기를 사용한다. 세포 카운터의 도움으로 각 샘플의 비드 수를 결정하십시오. 분광형광계를 이용하여 각 비드 시료의 형광 강도를 가용성 형광염료의 농도로 변환하고 분광형광계 분자의 수에 대한 형광염료 농도를 재계산한다.각 샘플에 대한 플루로포어 분자의 수에 대한 유세포 분석기에서 비드의 평균 형광의 의존성 그래프를 작성한다. 그런 다음 분석 피팅을 사용하여 선 비례에 의한 의존성을 근사화하고 선형 탭을 순서대로 맞춥니다. 방정식의 근사치로부터, 평균 형광의 결합 부위로의 전환율을 계산한다.나중에 관심 소포 당 결합 부위의 겉보기 수를 계산하십시오. 대표적인 분석은 혼입된 친유성 형광염료인 염료 IC16과 함께 1마이크로미터 크기의 인공 형광체 지질 소포의 게이팅을 보여주며, 게이트는 형광염료 없이 동일한 크기의 인공 지질 소포를 포함하는 샘플을 기준으로 설정되었다. 소포에 결합하는 단백질의 동역학을 샘플을 연속적으로 수집하여 첫 번째 단계에서 분석하였다.얻어진 데이터는 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 유세포 측정은 용액을 혼합하고 Tyrode의 완충액으로 희석 한 후 가능한 한 빨리 시작해야합니다. 제안 된 방법은 우수한 임시 해상도로 매우 민감하고 전달을 필요로하지 않는 막 상호 작용을 가져 오는 연구를위한 표면 플라즈마 공명으로 보완 될 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 접근성과 단순성입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

연구

생화학

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...