Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne ble støttet av et russisk Science Foundation-tilskudd 20-74-00133.

1. Fluorescerende proteinmerking
<ol><li>Materialforberedelse<ol>
<li>Forbered 1 M natriumbikarbonatbuffer, pH 9,0, oppbevar den ved 4 °C, og bruk den innen en uke.</li>
		<li>Klargjør 1,5 M hydroksylaminhydrokloridbuffer, pH 8,5, umiddelbart før bruk.</li>
		<li>Forbered en 10 mg/ml oppløsning av fluorescerende fargestoff (se materialtabellen) i dimetylsulfoksid. MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares i en måned ved -20 °C i mørket.</li>
		<li>Forbered løsninger av rensed...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

Den foreslåtte metoden kan tilpasses for en grov karakterisering av samspillet mellom proteiner med fosfolipidmembraner fra ulike kilder og sammensetninger. Den kvantitative strømningscytometrien som er beskrevet her, innrømmer overflateplasmonresonans (SPR) i flere parametere. Spesielt har den lavere følsomhet og tidsoppløsning og krever fluorescerende merking av proteiner. Fluorescerende merking kan føre til en endring i konformasjon og tap av aktivitet for mange proteiner og krever derfor nøye kontroll. Denne t...

Biomembraner skiller det indre innholdet i dyreceller og ekstracellulært rom. Legg merke til at membraner også omgir mikrovesicles dannet under cellens livssyklus og organeller. Cellemembranen består hovedsakelig av lipider og proteiner. Membranproteiner utfører signalerings-, strukturelle, transport- og limfunksjoner. Imidlertid er lipidbilayeren også viktig for sammenhengen mellom dyrecellen og det ekstracellulære rommet. Dette papiret foreslår en metode for å studere perifer interaksjon av eksterne proteiner med lipidmembranen.
Det mest slående eksemplet på reaksjoner som oppstår på det ytre membranlaget av en dyrecelle er blodkoagulasjonsreaksjonen. Et viktig trekk ved blodkoagulasjon er at alle hovedreaksjonene fortsetter på fosfolipidmembranene til celler og mikrovesikler som oppstår fra disse cellene og ikke i plasma 1,2,3. Membranavhengige reaksjoner inkluderer prosessen med å starte koagulasjon (på cellemembranene i subendotelet, betent endotel eller aktiverte immunceller, med deltakelse av en vevsfaktor), alle reaksjoner av hovedkaskadeaktivering av faktorer IX, X, protrombin; aktivering av faktor XI ved trombin (på membranene til aktiverte blodplater, erytrocytter, lipoproteiner og mikrovesicles); reaksjoner av protein C-banen; inaktivering av koagulasjonsenzymer (på membranene til endotelceller med deltakelse av trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-reseptor, heparansulfat); kontaktveireaksjoner (på membraner av blodplater og noen mikrovesicles med deltakelse av ukjente kofaktorer). Dermed er det umulig å undersøke blodkoagulasjon uten å studere samspillet mellom ulike plasmaproteiner med membranen av blodceller.
Dette dokumentet beskriver en strømningscytometribasert metode for å karakterisere samspillet mellom proteiner med lipidmembraner av celler eller mikrovesicles. Denne tilnærmingen ble opprinnelig foreslått å studere samspillet mellom blodplasma med blodplater og kunstige fosfolipid vesikler. Videre samhandler de fleste av de studerte proteinene direkte med negativt ladede membranfolipider, spesielt med fosfatidylserin 4,5. I tillegg er det proteiner hvis interaksjon med membranen er mediert av spesielle reseptorer6.
En viktig evne til strømningscytometri er å diskriminere mellom frie og bundne ligander uten ytterligere separasjon. Denne egenskapen av cytometri tillater studiet av ligand likevektsbinding ved endepunktet og bidrar til å utføre kontinuerlige kinetiske målinger. Teknikken er usofistikert og krever ikke kompleks prøvepreparering. Flowcytometri brukes aktivt til kvantitativt å studere dynamikken i interaksjon mellom fluorescerende peptider, reseptorer og G-proteiner i intakte og vaskemiddelgjennomtrengelige nøytrofiler7. Denne tilnærmingen gjelder også for å utforske protein-DNA-interaksjoner og kinetikken til endonukleaseaktivitet i sanntid8. Over tid ble denne metoden brukt til kvantitativt å studere proteinproteininteraksjoner med renset lipid vesicles9, eller mer generelt, med membranproteiner uttrykt i et svært effektivt Sf9-celleuttrykkssystem10. Kvantitative metoder er også beskrevet for karakterisering av protein-liposom interaksjoner ved hjelp av strømningcytometri for transmembrane proteiner11.
Denne teknikken bruker selvlagde kalibreringsperler for å unngå å bruke kommersielt tilgjengelige perler7. Kalibreringsperlene som ble brukt tidligere7 var ment å fungere med fluorescein, som substansielt begrenset sortimentet av tilgjengelige fluorescerende ligander på proteinene. I tillegg tilbyr dette dokumentet en ny måte å skaffe og analysere kinetiske data for rimelig tidsoppløsning. Selv om denne metoden er beskrevet for kunstige fosfolipid vesicles, er det ingen åpenbare begrensninger for tilpasningsevnen til celler, naturlige vesikler eller kunstige fosfolipid vesicles med en annen lipidsammensetning. Metoden beskrevet heri tillater estimering av parametrene for interaksjon (kpå, koff) og likevekt (Kd) og letter kvantitativ karakterisering av antall proteinbindingssteder på membranen. Vær oppmerksom på at denne teknikken gir et omtrentlig estimat av antall bindingsområder. Fordelene ved metoden er dens relative enkelhet, tilgjengelighet og tilpasningsevne til innfødte celler og naturlige og kunstige mikrovesicles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

I menneskekroppen fortsetter de fleste av de viktigste fysiologiske reaksjonene som er involvert i immunresponsen og blodkoagulasjonen på cellemembranene. Et viktig første skritt i enhver membranavhengig reaksjon er binding av protein på fosfolipidmembranen. En tilnærming til å studere proteininteraksjon med lipidmembraner er utviklet ved hjelp av fluorescerende merkede proteiner og strømningscytometri. Denne metoden tillater studiet av proteinmembraninteraksjoner ved hjelp av levende celler og naturlige eller kunstige fosfolipid vesicles. Fordelen med denne metoden er enkelheten og tilgjengeligheten av reagenser og utstyr. I denne metoden er proteiner merket med fluorescerende fargestoffer. Imidlertid kan både selvlagde og kommersielt tilgjengelige, fluorescerende merkede proteiner brukes. Etter konjugering med fluorescerende fargestoff inkuberes proteinene med en kilde til fosfolipidmembranen (mikrovesicles eller celler), og prøvene analyseres ved strømningscytometri. De oppnådde dataene kan brukes til å beregne kinetiske konstanter og likevekt Kd. I tillegg er det mulig å estimere omtrentlig antall proteinbindingssteder på fosfolipidmembranen ved hjelp av spesielle kalibreringsperler.

Strømningscytometrimetoden som er beskrevet her, brukes til å karakterisere bindingen av plasmakoagulasjonsproteiner til aktiverte blodplater. I tillegg ble fosfolipid vesicles PS:PC 20:80 brukt som et modellsystem. Dette papiret fokuserer hovedsakelig på kunstige fosfolipid vesicles som et eksempel. Parametrene til cytometeret, spesielt fotomultiplierrøret (PMT) spenning og kompensasjonen må velges for hver bestemt enhet, studieobjektet (celler, kunstige eller naturlige mikrovesicles) og fargestoffene som brukes. <...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Her beskriver vi et sett med metoder for å karakterisere samspillet mellom proteiner med membraner av celler eller mikrovesicles.

Analysere samspillet mellom fluorescerende merkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjelp av kvantitativ strømningscytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Ved hjelp av denne mengdestrømningscytometrimetoden kan forskere beregne kinetiske og likevekts skikker av brakt inn membraninteraksjon og estimere antall protein hentet inn av steder på PPH-membranen. Fordelene med denne metoden er enkelheten og tilgjengeligheten av reagenser og utstyr. Denne metoden er utelukkende for grunnleggende forskning.Protokollen ble utviklet for å studere protein lipid interaksjoner i blodberegning, og kan brukes på andre områder for å karakterisere samspillet mellom proteiner med ulike lipidmembraner. Metoden kan brukes til kvantitetsvurdering av ligandbindingsdynamikk på de ulike cellene og ligandtypene. Start kinetiske bindingsforsøk ved å fortynne fosfolipid vesikler i Tyrodes buffer til en konsentrasjon av en mikromolar og et totalt volum på 250 mikroliter.Bland deretter fluorescerende merket koagulasjonsfaktor X eller FX FD og en konsentrasjon på 500 nanomolar med fosfolipid vesiklene i et en-til-en-forhold for å få et totalt volum på 500 mikroliter. Injiser umiddelbart 500 mikroliter av blandet suspensjon i strømningscytometeret. Med en strømningshastighet med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nanometer og et utslippsfilter på 585 nanometer;med en bredde på 42 for kanal FL to.Deretter måler du gjennomsnittlig fluorescens i kanal FL fire med eksitasjon ved 633 nanometer og utslippsfilter ved 660 nanometer med en bredde på 20. Når metningen av binding oppnås, fortynn prøven raskt 20 ganger med Tyrodes buffer, og overvåk dissosiasjonen til en baseline fluorescens, eller et platå, nås. For likevektsbindingseksperimenter inkuberer fem mikromolar kunstige fosfolipid vesicles med varierende konsentrasjoner av FX FD fra null til 1000 nanomolar i Tyrodes buffer i 20 minutter.Etter inkubasjon fortynn hver prøve med 20 ganger til et endelig volum på 200 mikroliter med Tyrodes buffer, og analyser deretter den fortynnede prøven ved strømningscytometri innen 30 sekunder. For å analysere dataene, eksporter eksperimentene i FSC-format fra cytometri datainnsamlingsprogramvare til cytometerprogramvare for dataanalyse. Ved å velge filen og deretter klikke kategoriene for eksport- og FSC-filer.når du er ferdig, åpner du FCS-filene i cytometer-programvare ved å velge filene på datamaskinen og dra filene til programmets arbeidsområde. For å gating mikrovesicles, identifisere regionen av mikrovesicles ved fluorescens av lipofil fargestoff, DIC 16 tre. Bruk deretter tegneknappen i regnearket til å opprette en prikkplott SSC fra FL to D I C 16 i loggkoordinater.Velg deretter den rektangulære portknappen for å tegne et gatingområde. For å analysere kinetiske eksperimenter skape en prikk plott ved hjelp av koordinatene av fluorescens over tid for regionen av vesikler. Deretter eksporterer du dataene om endringen i fluorescens over tid i CSV-format;ved å gå til å velge prøve og høyreklikke på eksportfanen, etterfulgt av å velge FL fire ganger i parametere, velge katalog for lagring før du klikker på det valgte CSV-formatet og trykker på eksportfanen.Etter overføring åpner du CSV-filen i statistisk programvare for å beregne den enkle glidende gjennomsnittlige fluorescensen og tiden for hver 1000 hendelser omtrentlig en graf over avhengigheten av den enkelt bevegelige gjennomsnittlige fluorescensen i tide under forutsetning av eksponentiell avhengighet og bruke verdien til å beregne den kinetiske tilknytningskonstanten ved hjelp av en ligning. Beregn deretter den kinetiske dissosiasjonskonstanten ved hjelp av ligningen som beskrevet tidligere. For å analysere datoen for likevektsbindingsanalysen, bestem den gjennomsnittlige fluorescensen av FX FD i vesiklene for hver valgte konsentrasjon av FX FD og tilnærm deretter avhengigheten av den bundne faktoren fluorescens fra konsentrasjonen av den tilsatte faktoren i antagelsen av enkeltstedsbinding.Beregn de gjennomsnittlige bindingsparameterne ved hjelp av en ligning fra tre uavhengige gjentakelser på et minimum. Fortsett å forberede kalibrerte perler ved å inkubere gelfiltrerte blodplater med kalsium IANA 4A tjuetre, hundre og åtti syv i nærvær av 2,5 millimolar kalsiumklorid i 10 minutter ved romtemperatur. Tilsett de aktiverte blodplater de forskjellige konsentrasjonene av FX FD og inkuber blodplater med to volum prosent formaldehyd.Etter en time, stopp reaksjonen ved å inkubere blodplater med tre molar glycin og 5% BSA i 30 minutter ved romtemperatur. Rens deretter blandingen fra det uberørte fargestoffet med sentrifugering ved 400 ganger G i fem minutter. Fjern supernatet før du bruker pelletsen på nytt i Tyrodes buffer som inneholder 0,5 %BSA.Deretter måler du fluorescensnivået til kalibreringsperlene i hver prøve ved hjelp av et spektrofluorometer og deretter ved hjelp av strømningscytometeret. Bestem antall perler i hvert utvalg ved hjelp av en celleteller. Konverter fluorescensintensiteten til hver respektive perleprøve til konsentrasjonen av løselig fluorescerende fargestoff ved hjelp av et spektrofluorometer og omberegn fluorescerende fargekonsentrasjon for antall spektrofluorometermolekyler.Lag en avhengighetsgraf av gjennomsnittlig fluorescens av perlene i et strømningscytometer på antall flurophormolekyler for hver prøve. Tilnærm deretter avhengigheten etter linjeproporsjonalitet ved hjelp av analysetilpasningen og tilpass lineære tabulatorer i rekkefølge. Fra tilnærmingen i ligningen beregner du omregningsfaktoren for gjennomsnittlig fluorescens til bindingssteder.Senere beregne det tilsynelatende antallet bindende nettsteder per vesicle av interesse. Den representative analysen viser gating av de kunstige fosfor lipid vesikler som er ett mikrometer i størrelse med det inkorporerte lipofile fluorescerende fargestoffet, fargestoff I C 16, porten ble satt basert på en prøve som inneholder samme størrelse kunstige lipid vesikler uten fluorescerende fargestoff. Kinetikken til proteinbindingen til vesiklene ble analysert i første fase ved å samle prøven kontinuerlig.Dataene som ble innhentet ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. De strømningscytometriske målingene bør starte så snart som mulig etter blanding av løsningene og fortynning med Tyrodes buffer. Den foreslåtte metoden kan suppleres med overflateplasma resonans for å studere brakt inn membran interaksjoner som er svært følsomme med god midlertidig oppløsning og krever ikke brakt inn levering Den største fordelen med denne metoden er dens tilgjengelighet og enkelhet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Ligne Funksjon Melde Proteiner: Mot Kunstig signaltransduksjon Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Papirbasert preconcentration og isolering av mikrovesicles og exosomer

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Rask vurdering av membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...