Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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Os autores foram apoiados por uma bolsa da Fundação Russa de Ciência 20-74-00133.

1. Rotulagem de proteínas fluorescentes
<ol><li>Preparação do material<ol>
<li>Prepare 1 M tampão de bicarbonato de sódio, pH 9.0, armazene-o a 4 °C e use-o dentro de uma semana.</li>
		<li>Prepare 1,5 M de tampão de cloridrato de hidroxilamina, pH 8,5, imediatamente antes de usar.</li>
		<li>Prepare uma solução de 10 mg/mL de corante fluorescente (ver a Tabela de Materiais) em dimetilsulfoxida. NOTA: Esta solução pode ser armazenada por um mês a -20 °C no escuro.</li>
...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

O método proposto pode ser adaptado para uma caracterização áspera da interação de proteínas com membranas fosfolipítidas de várias fontes e composições. A citometria quantitativa de fluxo descrita aqui concede ressonância plasmon superficial (SPR) em vários parâmetros. Em particular, tem menor sensibilidade e resolução de tempo e requer rotulagem fluorescente de proteínas. A rotulagem fluorescente pode levar a uma mudança na conformação e perda de atividade para muitas proteínas e, portanto, requer ...

Os biomembranos separam o conteúdo interno das células animais e do espaço extracelular. Note que as membranas também circundam microvesículos formados durante o ciclo de vida da célula e organelas. A membrana celular é predominantemente composta de lipídios e proteínas. As proteínas da membrana realizam funções de sinalização, estrutural, transporte e adesivo. No entanto, o bicamador lipída também é essencial para a inter-relação da célula animal com o espaço extracelular. Este artigo propõe um método para estudar a interação periférica de proteínas externas com a membrana lipídica.
O exemplo mais marcante de reações ocorrendo na camada de membrana externa de uma célula animal é a reação de coagulação sanguínea. Uma característica importante da coagulação sanguínea é que todas as principais reações procedem nas membranas fosfolipítidas das células e microvesculas decorrentes dessas células e não no plasma 1,2,3. Reações dependentes de membrana incluem o processo de inicialidade da coagulação (nas membranas celulares do subendotélio, endotélio inflamado ou células imunes ativadas, com a participação de um fator tecidual), todas as reações da principal cascata-ativação dos fatores IX, X, protrombina; ativação do fator XI por trombina (nas membranas de plaquetas ativadas, eritrócitos, lipoproteínas e microvesculas); reações da via da proteína C; inativação de enzimas de coagulação (nas membranas das células endoteliais com a participação de cofatores trombomodulinas, receptor de proteína endotelial C, sulfato heparano); e reações de via de contato (em membranas de plaquetas e algumas microvesculas com a participação de cofatores desconhecidos). Assim, é impossível investigar a coagulação sanguínea sem estudar a interação de várias proteínas plasmáticas com a membrana das células sanguíneas.
Este artigo descreve um método baseado em fluxo-citometria para caracterizar a interação de proteínas com membranas lipídicas de células ou microvesculas. Esta abordagem foi inicialmente proposta para estudar a interação do plasma de sangue com plaquetas e vesículas fosfolipítias artificiais. Além disso, a maioria das proteínas estudadas interagem diretamente com fosfolipídios de membrana carregados negativamente, particularmente com fosfatidylserina 4,5. Além disso, existem proteínas cuja interação com a membrana é mediada por receptores especiais6.
Uma importante habilidade de citometria de fluxo é discriminar entre ligantes livres e vinculados sem separação adicional. Esta característica da citometria permite o estudo da ligação de ligantes no ponto final e ajuda a realizar medições cinéticas contínuas. A técnica não é sofisticada e não requer preparação complexa da amostra. A citometria de fluxo é usada ativamente para estudar quantitativamente a dinâmica de interação entre peptídeos fluorescentes, receptores e proteínas G em neutrófilos intactos e permeáveisdetergentes 7. Essa abordagem também é aplicável para explorar interações proteína-DNA e a cinética da atividade endonuclease em tempo real8. Com o tempo, este método foi utilizado para estudar quantitativamente interações proteína-proteína de alta afinidade com vesículas lipídicaspurificadas 9, ou, mais geralmente, com proteínas de membrana expressas em um sistema de expressão celular Sf9 altamente eficiente10. Métodos quantitativos também foram descritos para caracterizar interações proteína-lipossomo utilizando citometria de fluxo para proteínas transmembranas11.
Esta técnica usa contas de calibração auto-feitas para evitar o uso de contas disponíveis comercialmente7. As contas de calibração utilizadas anteriormente7 destinavam-se a trabalhar com fluoresceína, o que restringiu substantivamente a variedade de ligantes fluorescentes acessíveis nas proteínas. Além disso, este artigo oferece uma nova maneira de adquirir e analisar dados cinéticos para resolução de tempo razoável. Embora este método seja descrito para vesículas fosfolipídicas artificiais, não há limitações óbvias para sua adaptabilidade às células, vesículas naturais ou vesículas fosfolipídicas artificiais com uma composição lipídica diferente. O método aqui descrito permite a estimativa dos parâmetros de interação (kon, koff) e equilíbrio (Kd) e facilita a caracterização quantitativa do número de sítios de ligação proteica na membrana. Observe que esta técnica fornece uma estimativa aproximada do número de locais de ligação. As vantagens do método são sua relativa simplicidade, acessibilidade e adaptabilidade às células nativas e microvesculas naturais e artificiais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

No corpo humano, a maioria das principais reações fisiológicas envolvidas na resposta imune e coagulação sanguínea prosseguem nas membranas das células. Um primeiro passo importante em qualquer reação dependente da membrana é a ligação de proteína na membrana fosfolipítida. Uma abordagem para estudar a interação proteica com membranas lipídicas foi desenvolvida usando proteínas fluorescentes rotuladas e citometria de fluxo. Este método permite o estudo de interações proteína-membrana utilizando células vivas e vesículas fosfolipítias naturais ou artificiais. A vantagem deste método é a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Neste método, as proteínas são rotuladas usando corantes fluorescentes. No entanto, tanto proteínas auto-fabricadas quanto comercialmente disponíveis, podem ser usadas proteínas fluorescentes. Após a conjugação com um corante fluorescente, as proteínas são incubadas com uma fonte da membrana fosfolipítida (microvesculas ou células), e as amostras são analisadas por citometria de fluxo. Os dados obtidos podem ser usados para calcular as constantes cinéticas e o equilíbrio Kd. Além disso, é possível estimar o número aproximado de locais de ligação de proteínas na membrana fosfolipídida usando contas especiais de calibração.

O método de citometria de fluxo descrito aqui é usado para caracterizar a ligação de proteínas de coagulação plasmática a plaquetas ativadas. Além disso, as vesículas fosfolipídidas PS:PC 20:80 foram aplicadas como um sistema de modelo. Este artigo se concentra principalmente em vesículas fosfolipísides artificiais como exemplo. Os parâmetros do citómetro, em particular, a tensão do tubo fotomultiplier (PMT) e a compensação devem ser selecionados para cada dispositivo específico, o objeto de estudo (c?...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Aqui, descrevemos um conjunto de métodos para caracterizar a interação de proteínas com membranas de células ou microvesculas.

Analisando a Interação de Proteínas Fluorescentes com Microvesculas Fosfolipísicas Artificiais usando Citometria de Fluxo Quantitativo

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Usando esse método de citometria de fluxo de quantidade, os pesquisadores podem calcular os costumes cinéticos e de equilíbrio da interação com a membrana e estimar o número de proteínas trazidas por locais na membrana PPH. As vantagens deste método são a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Este método é exclusivamente para pesquisas básicas.O protocolo foi desenvolvido para estudar interações lipídicas proteicas no cálculo sanguíneo, podendo ser utilizado em outras áreas para caracterizar a interação de proteínas com várias membranas lipídicas. O método pode ser usado para a avaliação da quantidade de dinâmicas de ligação de ligantes nos vários tipos de células e ligantes. Inicie os experimentos de ligação cinética diluindo vesículas fosfolipídicas no buffer de Tyrode para uma concentração de um micromolar e um volume total de 250 microlitres.Em seguida, misture o fator de coagulação fluorescente X ou FX FD e uma concentração de 500 nanomolar com as vesículas fosfolipídidas em uma razão de um para um para obter um volume total de 500 microlitres. Injete imediatamente 500 microliters da suspensão mista no citômetro de fluxo. A uma taxa de fluxo com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um filtro de emissão de 585 nanômetros; com uma largura de 42 para o canal FL dois.Em seguida, meça a fluorescência média no canal FL quatro com excitação a 633 nanômetros e filtro de emissão a 660 nanômetros com uma largura de 20. Quando a saturação da ligação é alcançada rapidamente dilui a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode, e monitora a dissociação até que uma fluorescência de linha de base, ou um platô, seja atingida. Para experimentos de ligação de equilíbrio incubam cinco vesículas fosfolipícidas artificiais micromolar com concentrações variadas de FX FD de zero a 1000 nanomolar no buffer de Tyrode por 20 minutos.Após a incubação diluir cada amostra em 20 vezes para um volume final de 200 microliters com tampão de Tyrode, então analise a amostra diluída por citometria de fluxo dentro de 30 segundos. Para analisar os dados, exporte os experimentos em formato FSC do software de aquisição de dados de citometria para software de citógrafo para análise de dados. Escolhendo o arquivo e, em seguida, clicando nas guias de arquivos de exportação e FSC.uma vez feito abrir os arquivos FCS em software de citrômetro selecionando os arquivos no computador e arrastando os arquivos para o espaço de trabalho do programa. Para gating dos microvesículos, identifique a região dos microvesículos por fluorescência do corante lipofílico, DIC 16 três. Em seguida, use o botão plot na planilha para criar um SSC de gráfico de pontos a partir de FL dois D I C 16 em coordenadas de log.Em seguida, escolha o botão de portão retangular para desenhar uma região de gating. Para analisar os experimentos cinéticos, crie um gráfico de pontos usando as coordenadas da fluorescência ao longo do tempo para a região das vesículas. Em seguida, exporte os dados sobre a alteração da fluorescência ao longo do tempo no formato CSV;escolhendo a amostra e clicando com o botão direito do mouse na guia de exportação, seguido de escolher FL quatro vezes em parâmetros, selecionar diretório para salvar antes de clicar no formato CSV selecionado e acertar a guia de exportação.Após a transferência, abra o arquivo CSV em software estatístico para calcular a simples fluorescência e tempo da média móvel para cada 1000 eventos aproximam um gráfico da dependência da fluorescência média móvel única no tempo sob a suposição de dependência exponencial e usar o valor para calcular a associação cinética constante usando uma equação. Em seguida, calcule a constante de dissociação cinética usando a equação como descrito anteriormente. Para analisar a data do ensaio de vinculação de equilíbrio, determine a fluorescência média do FX FD na região das vesículas para cada concentração selecionada de FX FD e, em seguida, aproxime-se da dependência da fluorescência fator vinculado da concentração do fator adicionado na suposição de vinculação de local único.Calcule os parâmetros de ligação médio usando uma equação de três repetições independentes no mínimo. Prossiga para preparar contas calibradas incubando plaquetas filtradas em gel com cálcio IANA 4A vinte e três, cento e oitenta e sete na presença de 2,5 milimilas de cloreto de cálcio por 10 minutos à temperatura ambiente. As plaquetas ativadas adicionam as várias concentrações de FX FD e incubam as plaquetas com dois por cento de formaldeído.Após uma hora, pare a reação incubando as plaquetas com três glicina molar e 5%BSA por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, purifique a mistura do corante não redigido com centrifugação a 400 vezes G por cinco minutos. Remova o supernato antes de reutilizar a pelota no buffer de Tyrode contendo 0,5% BSA.Em seguida, meça o nível de fluorescência das contas de calibração em cada amostra usando um espectrômetro e, em seguida, usando o citômetro de fluxo. Determine o número de contas em cada amostra com a ajuda de um contador celular. Converta a intensidade da fluorescência de cada amostra de contas respectiva para a concentração de corante fluorescente solúvel usando um espectrômetro e recalcula a concentração de corante fluorescente para o número de moléculas de espectrofluorômetro.Crie um gráfico de dependência da fluorescência média das contas em um címetro de fluxo sobre o número de moléculas fluróforas para cada amostra. Em seguida, aproxime-se da dependência por proporcionalidade de linha usando o encaixe da análise e ajuste as guias lineares em ordem. A partir da aproximação na equação, calcule o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação.Mais tarde, calcule o número aparente dos sites vinculantes por vesícula de interesse. A análise representativa mostra o brilho das vesículas lipídicas de fósforo artificial que têm um micrômetro de tamanho com o corante fluorescente lipofílico incorporado, corante I C 16, o portão foi definido com base em uma amostra contendo vesículas lipídicas artificiais do mesmo tamanho sem o corante fluorescente. A cinética da proteína que liga as vesículas foi analisada no primeiro estágio coletando a amostra continuamente.Os dados obtidos foram analisados por meio de citometria de fluxo. As medidas citométricas de fluxo devem começar o mais rápido possível após a mistura das soluções e diluição com o buffer de Tyrode. O método proposto poderia ser complementado com ressonância plasmática superficial para estudos trazidos em interações de membrana que é altamente sensível com boa resolução temporária e não requer entrega A principal vantagem deste método é sua acessibilidade e simplicidade.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Bioquímica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

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Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...