Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
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Los autores fueron apoyados por una subvención de la Fundación Rusa de Ciencia 20-74-00133.

1. Etiquetado de proteínas fluorescentes
<ol><li>Preparación de materiales<ol>
<li>Prepare 1 M Tampón de bicarbonato de sodio, pH 9.0, guárdelo a 4 ° C y úselo dentro de una semana.</li>
		<li>Prepare 1.5 M de tampón de clorhidrato de hidroxilamina, pH 8.5, inmediatamente antes de su uso.</li>
		<li>Preparar una solución de 10 mg/ml de colorante fluorescente (ver la Tabla de Materiales) en dimetilsulfóxido. NOTA: Esta solución se puede almacenar durante un mes a -20 °C en...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

El método propuesto se puede adaptar para una caracterización aproximada de la interacción de proteínas con membranas de fosfolípidos de diversas fuentes y composiciones. La citometría de flujo cuantitativa descrita aquí concede a la resonancia de plasmón de superficie (SPR) en varios parámetros. En particular, tiene una menor sensibilidad y resolución de tiempo y requiere un etiquetado fluorescente de proteínas. El etiquetado fluorescente puede conducir a un cambio en la conformación y la pérdida de activid...

Las biomembranas separan el contenido interno de las células animales y el espacio extracelular. Tenga en cuenta que las membranas también rodean las microvesículas formadas durante el ciclo de vida de la célula y los orgánulos. La membrana celular está compuesta predominantemente de lípidos y proteínas. Las proteínas de membrana realizan funciones de señalización, estructurales, de transporte y adhesivas. Sin embargo, la bicapa lipídica también es esencial para la interrelación de la célula animal con el espacio extracelular. Este artículo propone un método para estudiar la interacción periférica de las proteínas externas con la membrana lipídica.
El ejemplo más sorprendente de reacciones que ocurren en la capa de membrana externa de una célula animal es la reacción de coagulación de la sangre. Una característica importante de la coagulación sanguínea es que todas las reacciones principales proceden sobre las membranas fosfolípidas de las células y microvesículas que surgen de estas células y no en el plasma 1,2,3. Las reacciones dependientes de la membrana incluyen el proceso de inicio de la coagulación (en las membranas celulares del subendotelio, el endotelio inflamado o las células inmunes activadas, con la participación de un factor tisular), todas las reacciones de la principal activación en cascada de los factores IX, X, protrombina; activación del factor XI por trombina (en las membranas de plaquetas, eritrocitos, lipoproteínas y microvesículas activadas); reacciones de la vía de la proteína C; inactivación de enzimas de coagulación (en las membranas de las células endoteliales con la participación de cofactores de trombomodulina, receptor de proteína C endotelial, sulfato de heparán); y reacciones de vía de contacto (en membranas de plaquetas y algunas microvesículas con la participación de cofactores desconocidos). Por lo tanto, es imposible investigar la coagulación de la sangre sin estudiar la interacción de varias proteínas plasmáticas con la membrana de las células sanguíneas.
Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo para caracterizar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas de las células o microvesículas. Este enfoque se propuso inicialmente para estudiar la interacción del plasma sanguíneo con plaquetas y vesículas artificiales de fosfolípidos. Además, la mayoría de las proteínas estudiadas interactúan directamente con fosfolípidos de membrana cargados negativamente, particularmente con fosfatidilserina 4,5. Además, hay proteínas cuya interacción con la membrana está mediada por receptores especiales6.
Una capacidad importante de la citometría de flujo es discriminar entre ligandos libres y unidos sin separación adicional. Esta característica de la citometría permite el estudio de la unión al equilibrio del ligando en el punto final y ayuda a realizar mediciones cinéticas continuas. La técnica es poco sofisticada y no requiere una preparación de muestras compleja. La citometría de flujo se utiliza activamente para estudiar cuantitativamente la dinámica de la interacción entre péptidos fluorescentes, receptores y proteínas G en neutrófilos intactos y permeables a detergente7. Este enfoque también es aplicable para explorar las interacciones proteína-ADN y la cinética de la actividad de la endonucleasa en tiempo real8. Con el tiempo, este método se utilizó para estudiar cuantitativamente las interacciones proteína-proteína de alta afinidad con vesículas lipídicas purificadas9, o, más generalmente, con proteínas de membrana expresadas en un sistema de expresión celular Sf9 altamente eficiente10. También se han descrito métodos cuantitativos para caracterizar las interacciones proteína-liposoma mediante citometría de flujo para proteínas transmembrana11.
Esta técnica utiliza perlas de calibración hechas por ellos mismos para evitar el uso de cuentas disponibles comercialmente7. Las perlas de calibración utilizadas anteriormente7 estaban destinadas a trabajar con fluoresceína, lo que restringía sustancialmente la variedad de ligandos fluorescentes accesibles en las proteínas. Además, este documento ofrece una nueva forma de adquirir y analizar datos cinéticos para una resolución de tiempo razonable. Aunque este método se describe para vesículas de fosfolípidos artificiales, no hay limitaciones obvias para su adaptabilidad a células, vesículas naturales o vesículas de fosfolípidos artificiales con una composición lipídica diferente. El método aquí descrito permite la estimación de los parámetros de interacción (kon, koff) y equilibrio (Kd) y facilita la caracterización cuantitativa del número de sitios de unión a proteínas en la membrana. Tenga en cuenta que esta técnica proporciona una estimación aproximada del número de sitios de unión. Las ventajas del método son su relativa simplicidad, accesibilidad y adaptabilidad a células nativas y microvesículas naturales y artificiales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

En el cuerpo humano, la mayoría de las principales reacciones fisiológicas involucradas en la respuesta inmune y la coagulación de la sangre proceden en las membranas de las células. Un primer paso importante en cualquier reacción dependiente de la membrana es la unión de la proteína en la membrana de fosfolípidos. Se ha desarrollado un enfoque para estudiar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas utilizando proteínas marcadas fluorescentemente y citometría de flujo. Este método permite el estudio de las interacciones proteína-membrana utilizando células vivas y vesículas de fosfolípidos naturales o artificiales. La ventaja de este método es la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. En este método, las proteínas se etiquetan utilizando colorantes fluorescentes. Sin embargo, se pueden utilizar proteínas autofabricadas y disponibles comercialmente, marcadas fluorescentemente. Después de la conjugación con un colorante fluorescente, las proteínas se incuban con una fuente de la membrana de fosfolípidos (microvesículas o células), y las muestras se analizan por citometría de flujo. Los datos obtenidos se pueden utilizar para calcular las constantes cinéticas y el equilibrio Kd. Además, es posible estimar el número aproximado de sitios de unión a proteínas en la membrana de fosfolípidos utilizando perlas de calibración especiales.

El método de citometría de flujo descrito en este documento se utiliza para caracterizar la unión de las proteínas de coagulación plasmática a las plaquetas activadas. Además, se aplicaron vesículas de fosfolípidos PS:PC 20:80 como sistema modelo. Este artículo se centra principalmente en las vesículas artificiales de fosfolípidos como ejemplo. Los parámetros del citómetro, en particular, la tensión del tubo fotomultiplicador (PMT) y la compensación deben seleccionarse para cada dispositivo específico, e...

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Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Usando este método de citometría de flujo cuantitativo, los investigadores pueden calcular las costumbres cinéticas y de equilibrio de la interacción de membrana traída y estimar el número de proteínas traídas por los sitios en la membrana PPH. Las ventajas de este método son la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. Este método es exclusivamente para la investigación básica.El protocolo fue desarrollado para estudiar las interacciones de lípidos de proteínas en el cálculo de sangre, y se puede utilizar en otras áreas para caracterizar la interacción de proteínas con varias membranas lipídicas. El método se puede utilizar para la evaluación cuantitativa de la dinámica de unión al ligando en las diversas células y tipos de ligandos. Comience los experimentos de unión cinética diluyendo las vesículas de fosfolípidos en el tampón de Tyrode a una concentración de un micromolar y un volumen total de 250 microlitros.Luego mezcle el factor de coagulación X o FX FD marcado con fluorescentes y una concentración de 500 nanomolares con las vesículas de fosfolípidos en una proporción de uno a uno para obtener un volumen total de 500 microlitros. Inyecte inmediatamente 500 microlitros de la suspensión mixta en el citómetro de flujo. A un caudal con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y un filtro de emisión de 585 nanómetros; con un ancho de 42 para el canal FL dos.A continuación, mida la fluorescencia media en el canal FL cuatro con excitación a 633 nanómetros y filtro de emisión a 660 nanómetros con un ancho de 20. Cuando se logra la saturación de unión, diluya rápidamente la muestra 20 veces con el tampón de Tyrode y controle la disociación hasta que se alcance una fluorescencia basal, o una meseta. Para los experimentos de unión al equilibrio, incube cinco vesículas de fosfolípidos artificiales micromolares con concentraciones variables de FX FD de cero a 1000 nanomolares en el tampón de Tyrode durante 20 minutos.Después de la incubación, diluya cada muestra 20 veces hasta un volumen final de 200 microlitros con el tampón de Tyrode y luego analice la muestra diluida por citometría de flujo en 30 segundos. Para analizar los datos, exporte los experimentos en formato FSC desde el software de adquisición de datos de citometría al software de citómetro para el análisis de datos. Al elegir el archivo y, a continuación, hacer clic en las fichas Exportar archivos y ARCHIVOS FSC.una vez hecho esto, abra los archivos FCS en el software del citómetro seleccionando los archivos en la computadora y arrastrando los archivos al espacio de trabajo del programa. Para la apertura de las microvesículas, identifique la región de las microvesículas por fluorescencia del colorante lipofílico, DIC 16 tres. A continuación, utilice el botón de trazado de la hoja de cálculo para crear un diagrama de puntos SSC a partir de FL dos D I C 16 en coordenadas de registro.A continuación, elija el botón de puerta rectangular para dibujar una región de cierre. Para analizar los experimentos cinéticos, cree un diagrama de puntos utilizando las coordenadas de fluorescencia a lo largo del tiempo para la región de las vesículas. A continuación, exporte los datos sobre el cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo en el formato CSV; yendo a elegir muestra y haciendo clic derecho en la pestaña de exportación, seguido de elegir FL cuatro veces en parámetros, seleccione el directorio para guardar antes de hacer clic en el formato CSV seleccionado y presione la pestaña de exportación.Después de la transferencia, abra el archivo CSV en el software estadístico para calcular la fluorescencia de la media móvil simple y el tiempo por cada 1000 eventos aproximados a un gráfico de la dependencia de la fluorescencia de la media móvil única en el tiempo bajo el supuesto de dependencia exponencial y use el valor para calcular la constante de asociación cinética utilizando una ecuación. A continuación, calcule la constante de disociación cinética utilizando la ecuación descrita anteriormente. Para analizar la fecha del ensayo de unión al equilibrio, determinar la fluorescencia promedio de FX FD en la región de las vesículas para cada concentración seleccionada de FX FD y luego aproximar la dependencia de la fluorescencia del factor unido de la concentración del factor agregado en la suposición de unión de sitio único.Calcule los parámetros de unión promedio utilizando una ecuación a partir de tres repeticiones independientes como mínimo. Proceda a preparar perlas calibradas incubando plaquetas filtradas en gel con calcio IANA 4A veintitrés, ciento ochenta y siete en presencia de cloruro de calcio 2,5 milimolar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas activadas agregan las diversas concentraciones de FX FD e incuban las plaquetas con dos volúmenes de formaldehído.Después de una hora, detenga la reacción incubando las plaquetas con tres glicina molar y 5% BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego purifique la mezcla del tinte no reaccionado con centrifugación a 400 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenado antes de volver a depositar el pellet en el tampón de Tyrode que contiene 0.5% BSA.A continuación, mida el nivel de fluorescencia de las perlas de calibración en cada muestra utilizando un espectrofluorómetro y luego usando el citómetro de flujo. Determine el número de cuentas en cada muestra con la ayuda de un contador de celdas. Convierta la intensidad de fluorescencia de cada muestra de perla respectiva a la concentración de colorante fluorescente soluble utilizando un espectrofluorómetro y recalcule la concentración de colorante fluorescente para el número de moléculas de espectrofluorómetro.Cree un gráfico de dependencia de la fluorescencia promedio de las perlas en un citómetro de flujo sobre el número de moléculas de fluróforo para cada muestra. A continuación, aproxime la dependencia por proporcionalidad de línea utilizando el ajuste de análisis y ajuste de tabulaciones lineales en orden. A partir de la aproximación en la ecuación, calcule el factor de conversión de la fluorescencia media a los sitios de unión.Más tarde calcule el número aparente de los sitios de unión por vesícula de interés. El análisis representativo muestra la apertura de las vesículas lipídicas de fósforo artificial que tienen un micrómetro de tamaño con el tinte fluorescente lipofílico incorporado, el tinte I C 16, la puerta se estableció en base a una muestra que contiene vesículas lipídicas artificiales del mismo tamaño sin el tinte fluorescente. La cinética de la unión de la proteína a las vesículas se analizó en la primera etapa mediante la recolección continua de la muestra.Los datos obtenidos fueron analizados mediante citometría de flujo. Las mediciones citométricas de flujo deben comenzar tan pronto como sea posible después de mezclar las soluciones y diluir con el tampón de Tyrode. El método propuesto podría complementarse con resonancia de plasma superficial para el estudio de las interacciones de membrana traídas que es altamente sensible con buena resolución temporal y no requiere entrega traída La principal ventaja de este método es su accesibilidad y simplicidad.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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