Name: analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna stöddes av ett bidrag från Russian Science Foundation 20-74-00133.

1. Fluorescerande proteinmärkning
<ol><li>Materialberedning<ol>
<li>Förbered 1 M natriumbikarbonatbuffert, pH 9,0, förvara den vid 4 °C och använd den inom en vecka.</li>
		<li>Bered 1,5 M hydroxylaminhydrokloridbuffert, pH 8,5, omedelbart före användning.</li>
		<li>Bered en 10 mg/ml lösning av fluorescerande färgämne (se materialförteckningen) i dimetylsulfoxid. OBS: Denna lösning kan förvaras i en månad vid -20 °C i mörker.</li>
		<li>Bered lösningar av renade an...

<ol>
	<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+hemostasis.">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li><li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+model+of+thrombin+generation.">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).</li><li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry:+roles+of+geometry,+flow+and+diffusion.">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li><li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X/Xa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization.">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex.">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li><li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations:+roles+of+integrin+&#945;IIb&#946;3+and+fibrinogen.">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin &#945;IIb&#946;3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li><li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand,+receptor,+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry.">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li><li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry.">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li><li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+analysis+of+receptor&#8722;G+protein+interactions+in+cell+membranes.">Fluorescence analysis of receptor&#8722;G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li><li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry:+determinants+of+Gi1+and+by+binding.">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li><li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes.">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li></ol>

Den föreslagna metoden kan anpassas för en grov karakterisering av interaktionen mellan proteiner och fosfolipidmembran från olika källor och kompositioner. Den kvantitativa flödescytometrin som beskrivs här medger ytplasmonresonans (SPR) i flera parametrar. I synnerhet har den en lägre känslighet och tidsupplösning och kräver fluorescerande märkning av proteiner. Fluorescerande märkning kan leda till en förändring i konformation och förlust av aktivitet för många proteiner och kräver därför noggrann ...

Biomembraner separerar det inre innehållet i djurceller och extracellulärt utrymme. Observera att membran också omger mikrovesiklar som bildas under cellens livscykel och organeller. Cellmembranet består huvudsakligen av lipider och proteiner. Membranproteiner utför signalerings-, struktur-, transport- och limfunktioner. Lipid-dubbelskiktet är emellertid också viktigt för djurcellens inbördes förhållande med det extracellulära utrymmet. Detta papper föreslår en metod för att studera den perifera interaktionen mellan externa proteiner och lipidmembranet.
Det mest slående exemplet på reaktioner som uppträder på det yttre membranskiktet hos en djurcell är blodkoagulationsreaktionen. En viktig egenskap hos blodkoagulation är att alla huvudreaktioner fortsätter på fosfolipidmembranen i celler och mikrovesiklar som härrör från dessa celler och inte i plasma 1,2,3. Membranberoende reaktioner innefattar processen att starta koagulering (på cellmembranen i subendotelet, inflammerat endotel eller aktiverade immunceller, med deltagande av en vävnadsfaktor), alla reaktioner av huvudkaskadaktiveringen av faktorer IX, X, protrombin; aktivering av faktor XI med trombin (på membranen av aktiverade blodplättar, erytrocyter, lipoproteiner och mikrovesiklar); reaktioner av protein C-vägen; inaktivering av koagulationsenzymer (på membranen av endotelceller med deltagande av trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-receptor, heparansulfat); och kontaktvägsreaktioner (på membran av blodplättar och vissa mikrovesiklar med deltagande av okända kofaktorer). Således är det omöjligt att undersöka blodkoagulation utan att studera interaktionen mellan olika plasmaproteiner och membranet i blodceller.
Denna uppsats beskriver en flödescytometribaserad metod för att karakterisera interaktionen mellan proteiner och lipidmembran i celler eller mikrovesiklar. Detta tillvägagångssätt föreslogs ursprungligen för att studera interaktionen mellan blodplasma och blodplättar och artificiella fosfolipidblåsor. Dessutom interagerar de flesta av de studerade proteinerna direkt med negativt laddade membranfosfolipider, särskilt med fosfatidylserin 4,5. Dessutom finns det proteiner vars interaktion med membranet förmedlas av speciella receptorer6.
En viktig förmåga hos flödescytometri är att skilja mellan fria och bundna ligander utan ytterligare separation. Denna funktion av cytometri möjliggör studier av ligandjämviktsbindning vid slutpunkten och hjälper till att utföra kontinuerliga kinetiska mätningar. Tekniken är osofistikerad och kräver inte komplex provberedning. Flödescytometri används aktivt för att kvantitativt studera dynamiken i interaktionen mellan fluorescerande peptider, receptorer och G-proteiner i intakta och tvättmedelsgenomsläppliga neutrofiler7. Detta tillvägagångssätt är också tillämpligt för att utforska protein-DNA-interaktioner och kinetiken för endonukleasaktivitet i realtid8. Med tiden användes denna metod för att kvantitativt studera protein-proteininteraktioner med hög affinitet med renade lipidblåsor9, eller mer allmänt med membranproteiner uttryckta i ett mycket effektivt Sf9-celluttryckssystem10. Kvantitativa metoder har också beskrivits för att karakterisera protein-liposominteraktioner med hjälp av flödescytometri för transmembranproteiner11.
Denna teknik använder självtillverkade kalibreringspärlor för att undvika att använda kommersiellt tillgängliga pärlor7. Kalibreringspärlorna som användes tidigare7 var avsedda att arbeta med fluorescein, vilket väsentligt begränsade sortimentet av tillgängliga fluorescerande ligander på proteinerna. Dessutom erbjuder detta dokument ett nytt sätt att förvärva och analysera kinetiska data för rimlig tidsupplösning. Även om denna metod beskrivs för artificiella fosfolipidblåsiklar, finns det inga uppenbara begränsningar för dess anpassningsförmåga till celler, naturliga vesiklar eller konstgjorda fosfolipidblåsiklar med en annan lipidkomposition. Metoden som beskrivs häri möjliggör uppskattning av parametrarna för interaktion (kpå, kav) och jämvikt (Kd) och underlättar kvantitativ karakterisering av antalet proteinbindningsställen på membranet. Observera att den här tekniken ger en ungefärlig uppskattning av antalet bindningsställen. Fördelarna med metoden är dess relativa enkelhet, tillgänglighet och anpassningsförmåga till inhemska celler och naturliga och konstgjorda mikrovesiklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A23187</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37573</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCantoII</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O332-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiIC16(3) (1,1&#39;-Dihexadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>Am-O105B-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>cytometry data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>cytometer software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Factor X</td>
			<td>Enzyme research</td>
			<td>HFX 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141914.1209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840053P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840032P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR Life Science AMRESCO</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0033-01</td>
			<td>gel filtration medium for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-2B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CL2B300-500ML</td>
			<td>gel filtration medium for platelet purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-065-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3139-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin collumns with membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the interaction of fluorescent-labeled proteins with artificial phospholipid microvesicles using quantitative flow cytometry

I människokroppen fortsätter de flesta av de stora fysiologiska reaktionerna som är involverade i immunsvaret och blodkoagulationen på cellernas membran. Ett viktigt första steg i någon membranberoende reaktion är bindning av protein på fosfolipidmembranet. Ett tillvägagångssätt för att studera proteininteraktion med lipidmembran har utvecklats med hjälp av fluorescerande märkta proteiner och flödescytometri. Denna metod möjliggör studier av protein-membraninteraktioner med användning av levande celler och naturliga eller artificiella fosfolipidblåsor. Fördelen med denna metod är enkelheten och tillgängligheten av reagens och utrustning. I denna metod märks proteiner med användning av fluorescerande färgämnen. Men både självtillverkade och kommersiellt tillgängliga, fluorescerande märkta proteiner kan användas. Efter konjugering med ett fluorescerande färgämne inkuberas proteinerna med en källa till fosfolipidmembranet (mikrovesiklar eller celler) och proverna analyseras med flödescytometri. De erhållna data kan användas för att beräkna de kinetiska konstanterna och jämvikten Kd. Dessutom är det möjligt att uppskatta det ungefärliga antalet proteinbindningsställen på fosfolipidmembranet med användning av speciella kalibreringspärlor.

Flödescytometrimetoden som beskrivs häri används för att karakterisera bindningen av plasmakoagulationsproteiner till aktiverade blodplättar. Dessutom applicerades fosfolipidblåsiklar PS: PC 20:80 som ett modellsystem. Detta dokument fokuserar främst på konstgjorda fosfolipidblåsiklar som ett exempel. Cytometerns parametrar, i synnerhet fotomultiplikatorrörets (PMT) spänning och kompensationen måste väljas för varje specifik anordning, studieobjektet (celler, konstgjorda eller naturliga mikrovesiklar) och d...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry at JoVE.com

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Här beskriver vi en uppsättning metoder för att karakterisera interaktionen mellan proteiner och membran av celler eller mikrovesiklar.

Analysera interaktionen mellan fluorescerande märkta proteiner med konstgjorda fosfolipidmikrovesiklar med hjälp av kvantitativ flödescytometri

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Med hjälp av denna kvantitetsflödescytometrimetod kan forskare beräkna kinetiska och jämviktsseder för inmat membraninteraktion och uppskatta antalet protein som förs in av platser på PPH-membranet. Fördelarna med denna metod är enkelheten och tillgängligheten av reagens och utrustning. Denna metod är uteslutande för grundforskning.Protokollet utvecklades för att studera proteinlipidinteraktioner vid blodberäkning och kan användas inom andra områden för att karakterisera interaktionen mellan proteiner och olika lipidmembran. Metoden kan användas för kvantitetsbedömning av ligandbindningsdynamik på de olika cellerna och ligandtyperna. Starta de kinetiska bindningsexperimenten genom att späda ut fosfolipidblåsor i Tyrodes buffert till en koncentration av en mikromolar och en total volym på 250 mikroliter.Blanda sedan fluorescerande märkt koagulationsfaktor X eller FX FD och en koncentration av 500 nanomolär med fosfolipidblåsorna i ett till ett förhållande för att få en total volym på 500 mikroliter. Injicera omedelbart 500 mikroliter av den blandade suspensionen i flödescytometern. Vid en flödeshastighet med en excitationsvåglängd på 488 nanometer och ett emissionsfilter på 585 nanometer,med en bredd av 42 för kanal FL två.Mät sedan medelvärdet för fluorescens i kanal FL fyra med excitation vid 633 nanometer och emissionsfilter vid 660 nanometer med en bredd på 20. När bindningsmättnaden uppnås späds provet snabbt 20 gånger med Tyrodes buffert och övervaka dissociationen tills en baslinjefluorescens, eller en platå, uppnås. För jämviktsbindningsexperiment inkubera fem mikromolära konstgjorda fosfolipidblåsor med varierande koncentrationer av FX FD från noll till 1000 nanomolar i Tyrodes buffert i 20 minuter.Efter inkubation späds varje prov med 20 gånger till en slutlig volym på 200 mikroliter med Tyrodes buffert och analysera sedan det utspädda provet med flödescytometri inom 30 sekunder. För att analysera data, exportera experimenten i FSC-format från cytometri datainsamlingsprogramvara till cytometerprogramvara för dataanalys. Genom att välja filen och sedan klicka på flikarna export och FSC-filer.när du är klar öppnar du FCS-filerna i cytometerprogramvaran genom att välja filerna på datorn och dra filerna till programmets arbetsyta. För att slå mikrovesiklarna, identifiera regionen av mikrovesiklar genom fluorescens av det lipofila färgämnet, DIC 16 tre. Använd sedan plotknappen i kalkylbladet för att skapa en punktplott SSC från FL två D I C 16 i loggkoordinater.Välj sedan den rektangulära grindknappen för att rita ett grindområde. För att analysera de kinetiska experimenten skapar du en punktplott med hjälp av koordinaterna för fluorescens över tiden för vesiklarnas område. Exportera sedan data om förändringen i fluorescens över tid i CSV-format;genom att välja prov och högerklicka på exportfliken, följt av att välja FL fyra gånger i parametrar, välj katalog för att spara innan du klickar på välj CSV-format och tryck på exportfliken.Efter överföring öppnar du CSV-filen i statistisk programvara för att beräkna det enkla glidande medelvärdet fluorescens och tid för varje 1000 händelser approximerar ett diagram över beroendet av det enda glidande medelvärdet fluorescens i tid under antagandet om exponentiellt beroende och använd värdet för att beräkna den kinetiska associeringskonstanten med hjälp av en ekvation. Beräkna sedan den kinetiska dissociationskonstanten med hjälp av ekvationen som beskrivits tidigare. För att analysera datumet för jämviktsbindningsanalysen, bestäm den genomsnittliga fluorescensen av FX FD i vesiklarområdet för varje vald koncentration av FX FD och approximera sedan beroendet av den bundna faktorn fluorescens från koncentrationen av den tillsatta faktorn i antagandet om bindning på ett enda ställe.Beräkna de genomsnittliga bindningsparametrarna med hjälp av en ekvation från tre oberoende upprepningar som ett minimum. Fortsätt att förbereda kalibrerade pärlor genom att inkubera gelfiltrerade blodplättar med kalcium IANA 4A tjugotre, hundra åttiosju i närvaro av 2,5 millimolär kalciumklorid i 10 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt de aktiverade blodplättarna de olika koncentrationerna av FX FD och inkubera blodplättarna med två volymprocent formaldehyd.Efter en timme, stoppa reaktionen genom att inkubera blodplättarna med tre molar glycin och 5% BSA i 30 minuter vid rumstemperatur. Rena sedan blandningen från det oreagerade färgämnet med centrifugering vid 400 gånger G i fem minuter. Ta bort supernaten innan du återanvänder pelleten i Tyrodes buffert som innehåller 0,5% BSA.Mät sedan fluorescensnivån för kalibreringspärlorna i varje prov med hjälp av en spektrofluorometer och sedan med hjälp av flödescytometern. Bestäm antalet pärlor i varje prov med hjälp av en cellräknare. Konvertera fluorescensintensiteten för varje respektive pärlprov till koncentrationen av lösligt fluorescerande färgämne med hjälp av en spektrofluorometer och beräkna om den fluorescerande färgkoncentrationen för antalet spektrofluorometermolekyler.Skapa en beroendegraf över pärlornas genomsnittliga fluorescens i en flödescytometer på antalet fluroformolekyler för varje prov. Approximera sedan beroendet genom linjeproportionalitet med hjälp av analyspassningen och passa linjära flikar i ordning. Från approximationen i ekvationen beräknar du omvandlingsfaktorn för medelfluorescensen till bindningsställen.Beräkna senare det uppenbara antalet bindningsställen per vesikel av intresse. Den representativa analysen visar gating av de konstgjorda fosforlipidblåsorna som är en mikrometer stora med det införlivade lipofila fluorescerande färgämnet, färgämne I C 16, porten sattes baserat på ett prov som innehåller samma storlek konstgjorda lipidblåsor utan det fluorescerande färgämnet. Kinetiken hos proteinbindningen till vesiklarna analyserades i det första steget genom att samla provet kontinuerligt.De erhållna data analyserades med hjälp av flödescytometri. Flödescytometriska mätningar bör starta så snart som möjligt efter blandning av lösningarna och utspädning med Tyrodes buffert. Den föreslagna metoden skulle kunna kompletteras med ytplasmaresonans för att studera införda membraninteraktioner som är mycket känsliga med god tillfällig upplösning och inte kräver leverans Den största fördelen med denna metod är dess tillgänglighet och enkelhet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitera funktionen av signalproteiner: Toward Artificial Signaltransduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-polymeras aktivitet Assay använder infrarött fluorescerande märkt DNA visualiseras med akrylamid gelelektrofores

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Pappersbaserad förkoncentration och isolering av mikrovesiklar och exosomer

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Snabb bedömning av membranproteinkvalitet genom fluorescerande storleksuteslutningskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...