Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R00AG047198 & R56AG062169 إلى EJB; R00HL140106 إلى PWP) وجمعية الزهايمر (AZRGD-21-805835 إلى PWP). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو جمعية الزهايمر.

يجب على المجربين التأكد من أن الاستخدام المعين للحيوانات والبروتوكولات المرتبطة بها تتم الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) ويتم تنفيذه وفقا ل دليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المجلس الوطني للبحوث (الطبعة 8 ، 2011) وإرشادات ARRIVE. وافقت IACUC من جامعة لوم?...

<ol>
	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الأمراض الدماغية الوعائية (CVD) والشيخوخة ومرض الزهايمر مرتبطة ارتباطا وثيقا وهي موضوع حالي لأبحاث الخرف4،8،14،21. وبالتالي ، من الواضح أن دراسات الشبكة الدماغية الوعائية سيكون لها تأثير واسع ...

توفر الشرايين المتنية مباشرة الأكسجين والمواد المغذية الأساسية في جميع أنحاء الدماغ1. أثناء التفاعل مع الشعيرات الدموية ، تستجيب الشرايين عالية النشاط للأوعية الدموية للإشارات الرجعية التي تبدأها قنوات الأيونات الشعرية التي تستشعر إشارات التمثيل الغذائي من مناطق عصبية محددة2. مع تلقي حمة الدماغ تاريخيا الجزء الأكبر من التحقيق ، ظهر الآن دور للخلل الوظيفي البطاني لتوضيح الآليات المرضية المرتبطة بمختلف الاضطرابات الدماغية الوعائية التي تكمن وراء الخرف (على سبيل المثال ، السكتة الدماغية الإقفارية ، مرض الزهايمر)3،4،5،6 . البطانة هي جزء لا يتجزأ من تروية الدماغ وفقا لعدم تجانس علم الوراثة والبنية والوظيفة في جميع أنحاء قطاعات الأوعية الدموية7. تمت دراسة شرايين Pial على نطاق واسع بسبب حجمها الكبير نسبيا ، ومقاومة الأوعية الدموية القطاعية العالية ، ودورها في توزيع تدفق الدم إلى الدماغ الأساسي 8,9. وبالتالي ، من المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للآليات البطانية الشريانية إلى تعزيز فهم تنظيم تدفق الدم في الدماغ في الصحة والمرض نحو تطوير أنظمة علاجية جديدة.
تسلط الأدلة الناشئة الضوء على أهمية دراسة الشرايين المتنية فيما يتعلق بمسارات الإشارات المختلفة والأمراض 8,10. ومع ذلك ، فقد اقتصر هذا النهج على استخدام الشرايين المضغوطة11 السليمة و / أو مستحضرات الشرايين الشعرية المتنية (CaPA)12. لم يتم فحص الخلايا البطانية الشريانية الدماغية الأصلية المعزولة حديثا والخالية من أنواع الخلايا الأخرى والعوامل المربكة ، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزلها. تقدم هذه الورقة تقنية سابقة تسلط الضوء على عزل البطانة الشريانية13 حتى الآن بشكل موثوق ومتكرر عزل بطانة الشرايين المتنية في الدماغ (العرض: ~ 25 ميكرومتر ، الطول: ~ 250 ميكرومتر). تساعد هذه التقنية على تحقيق الدقة المثلى للخلايا المقترنة كهربائيا وكيميائيا في اتجاهها الفردي وشبكاتها الخلوية.
وشملت المسارات الرئيسية المثيرة للاهتمام تفاعل إشارات Ca 2+ داخل الخلايا ([Ca2+]i) وفرط استقطاب إمكانات الغشاء (Vm)14,15 - وهو جزء لا يتجزأ من توسع الأوعية 16 - للسماح للدم بدخول الشعيرات الدموية وتوصيل الأكسجين والمواد المغذية إلى الحمة النشطة 17. تسمح هذه المستحضرات بتسجيلات كهروفسيولوجية في الوقت الفعلي للقنوات الأيونية ، بما في ذلك Ca2 + ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) وقنوات K + و / أو التصوير الفلوري للعضيات داخل الخلايا داخل أنابيب الخلايا البطانية في ظروف شبه فسيولوجية. هذه تقنية مناسبة للباحثين المهتمين بالآليات الخلوية الفسيولوجية التي تحكم تحكم تحكم الخلايا البطانية في توصيل تدفق الدم الدماغي إلى حمة الدماغ. وإجمالا، ستساعد هذه التقنية الباحثين على فهم مسارات الإشارات البطانية الأساسية والتواصل الشبكي للشرايين المضمنة في حمة الدماغ بشكل أفضل أثناء معالجة الأسئلة المتعلقة بفسيولوجيا الأوعية الدموية الدماغية وعلم الأمراض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

يتم نقل تدفق الدم الدماغي عن طريق الشرايين المقاومة للأوعية الدموية والشرايين المتنية في المصب. تزداد مقاومة الأوعية الدموية الثابتة لتدفق الدم مع انخفاض القطر من الشرايين إلى الشرايين التي تغذي الشعيرات الدموية في نهاية المطاف. نظرا لصغر حجمها وموقعها في الحمة ، فقد لم تتم دراسة الشرايين بشكل كاف نسبيا ومع قابلية أقل للتكرار في النتائج من الشرايين البينية السطحية. وبغض النظر عن ذلك، فإن بنية الخلايا البطانية الشريانية ووظيفتها - وهي جزء لا يتجزأ من فسيولوجيا ومسببات الأمراض التنكسية المزمنة - تتطلب تحقيقا مكثفا. على وجه الخصوص ، تظهر الأدلة الناشئة أن الوظيفة البطانية المعرضة للخطر تسبق وتفاقم الضعف المعرفي والخرف.
في دوران الأوعية الدقيقة المتني ، تعد وظيفة قناة K + البطانية أقوى حافز للتحكم بدقة في انتشار توسع الأوعية لتعزيز الزيادات في تدفق الدم إلى مناطق النشاط العصبي. توضح هذه الورقة طريقة مكررة لعزل "الأنابيب" البطانية السليمة والمقترنة كهربائيا (قطرها ، ~ 25 ميكرومتر) من الشرايين المتنية في دماغ الفأر. يتم تأمين الأنابيب البطانية الشريانية خلال الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية ، درجة الحموضة 7.4) لحل المتغيرات التجريبية التي تشمل وظيفة قناة K + وتنظيمها ، بما في ذلك ديناميكيات Ca2 + داخل الخلايا ، والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وتنظيم الدهون الغشائية. الميزة التقنية المميزة مقابل البطانة الشريانية هي الدقة المورفولوجية المعززة لأبعاد الخلايا والعضيات (مثل الميتوكوندريا) ، مما يوسع فائدة هذه التقنية. ينطوي التروية الدماغية الصحية طوال الحياة على وظيفة بطانية قوية في الشرايين المتنية ، مما يربط مباشرة تدفق الدم بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء المناطق التشريحية الدقيقة من الدماغ. وبالتالي ، من المتوقع أن تقدم هذه الطريقة بشكل كبير المعرفة العامة لفسيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الأعصاب فيما يتعلق بالدماغ السليم والمريض.

يظهر عرض توضيحي للبروتوكول في الشكل 1 مع خطوات تشريح الشرايين وعزل الأنبوب البطاني في الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. هنا ، تم تقييم الوظيفة البطانية عن طريق قياس [Ca 2 +] i و Vm باستخدام القياس الضوئي Fura-2 والفيزيولوجيا الكهربية الحادة...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

يتم توضيح التحضير المكثف ل "أنابيب" البطانية الدماغية للفئران السليمة من الشرايين المتنية الدماغية لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي. علاوة على ذلك ، نوضح نقاط القوة التجريبية لنموذج الدراسة البطانية هذا للتصوير الفلوري وقياس الفيزيولوجيا الكهربية لمسارات الإشارات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التغيرات في داخل الخلايا [Ca2+] وإمكانات الغشاء.

العزل والتحليل الوظيفي للبطانة الشريانية لحمة دماغ الفأر

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

ستوفر هذه الطريقة نظرة أفضل على وظيفة بطانة الشرايين المتنية التي تربط مباشرة تدفق الدم داخل المخ بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء الدماغ. ميزة تقنية متميزة على بطانة الشرايين هي الدقة المحسنة للأبعاد المورفولوجية والكالسيوم والإشارات الكهربائية بين الخلايا البطانية الفردية داخل المخ والعضيات الخاصة بها. في البداية ، سيكون عزل وفحص البطانة داخل المخ تحديا كبيرا.ومع ذلك ، من الممكن إتقان هذه التقنية مع الكثير من الممارسة مصحوبة بالصبر والتفاني. اغسل الدماغ المعزول بمحلول تشريح بارد في كوب أو طبق بتري لإزالة الدم المتبقي من سطح الدماغ. ضع جانب الدماغ البطني متجها لأعلى في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين المتني.لعزل الشرايين المتني، قم بتأمين الدماغ المعزول بدبابيس فولاذية في محلول تشريح بارد في طبق بتري يحتوي على طلاء بوليمر السيليكون المشبع بالفحم بعمق أكثر من 50 سم. قم بقص مستطيل من أنسجة المخ من نصفي الكرة الأرضية باستخدام مقص تشريح حاد ومحاذاة حول MCA مع التأكد من أن الجزء العلوي من جزء الأنسجة يتجاوز نقطة التفرع من دائرة ويليس. قم بتأمين أنسجة المخ في الطبق مع توجيه MCA لأعلى باستخدام دبابيس فولاذية.قم بعمل شق ضحل بعناية بالقرب من المسامير وقم بإزالة pia بملقط صغير ، مع تقشير بلطف من أحد الطرفين نحو الطرف الآخر. قم بتأمين pia المعزولة بعناية مع الشرايين المتنية المتفرعة من MCA في الطبق مع المسامير وتشريح الشرايين المتنية بعناية. اقطع أي فروع بعيدة متبقية وتأكد من نظافة الشرايين بدون أي أنسجة متصلة.استخدم هذا الشريان السليم النظيف للهضم الإنزيمي. بدلا من ذلك ، قم بقطع كل شريان إلى قطعتين للهضم الأنزيمي لإعداد أنابيب بطانية إذا رغبت في ذلك. للهضم الجزئي للشرائح الشريانية ، ضع شرائح الشرايين السليمة في ملليلتر واحد من محلول التفكك في أنبوب زجاجي سعة 10 ملليلتر يحتوي على غراء وثنائي ثيوريثريتول وكولاجيناز وإيلاستيز.احتضان شرائح الشرايين عند 34 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة. لعزل الأنبوب البطاني الشرياني ، ضع ماصة التريتوريشن المرفقة بحاقن المحقنة الدقيقة في محلول التفكك في الغرفة وضعها بالقرب من أحد طرفي جزء الوعاء المهضوم. اضبط معدلا ضمن نطاق واحد إلى ثلاثة نانولتر في الثانية على وحدة التحكم في المضخة لإجراء عملية سحب لطيفة.مع الحفاظ على تكبير 100X إلى 200X ، اسحب الجزء الشرياني إلى الماصة ثم حقن لفصل Adventitia وخلايا العضلات الملساء. قم بتقسيم جزء الوعاء إلى ثلاثة أضعاف حتى يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء وتبقى الخلايا البطانية فقط كأنبوب سليم. باستخدام المتلاعبين الدقيقين ، قم بتأمين كل طرف من الأنبوب البطاني على الغطاء الزجاجي في الغرفة باستخدام ماصات تثبيت زجاجية من البورسليكات لقياس إمكانات الغشاء البطاني ، أثناء المشاهدة من خلال هدف 4X ، ضع بعناية طرف القطب الحاد فوق خلية من الأنبوب البطاني الشرياني في محلول الملح الفسيولوجي المتدفق باستخدام متلاعب صغير.قم بزيادة التكبير تدريجيا إلى 400X وقم بتغيير موضع طرف القطب حسب الحاجة. باستخدام المتلاعب الدقيق ، أدخل بلطف طرف قطب كهربائي حاد في إحدى خلايا الأنبوب البطاني وابدأ في تسجيل VM باستخدام مقياس كهربائي. بمجرد أن يكون VM المستقر للراحة البطانية من ناقص 30 إلى ناقص 40 مللي فولت ، قم بتطبيق العوامل الدوائية المطلوبة لكل هدف تجريبي.قم بتحميل الأنبوب البطاني باستخدام متعقب التألق لغشاء البلازما أو العضية المطلوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. اغسل الخلايا بمحلول ملح فسيولوجي فائق الانصهار الطازج وصور الخلايا الحية تحت المجهر عند الطول الموجي المثير للأصباغ المعنية. تم تقييم الوظيفة البطانية عن طريق قياس الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات الغشاء استجابة للعامل الدوائي MTA ، وهو ناهض مستقبلات بيورينية قوي عند 37 درجة مئوية.عند تطبيق MTA ميكرومولار واحد ، يزداد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة مع فرط الاستقطاب المصاحب. علاوة على ذلك ، تم احتضان البطانة السليمة عند 37 درجة مئوية مع أجهزة تتبع الفلورسنت للتصور لفحص المورفولوجيا الخلوية. أظهر تصوير الخلايا البطانية الحية تلطيخا مشتركا لغشاء البلازما والنواة.تم تلطيخ غشاء البلازما مع بقعة فلورسنت شبكية إندوبلازمية حيث تظهر مناطق التداخل الواضح للطوارئ بالقرب من غشاء البلازما باللون البرتقالي. يجب أن يكون المجرب حذرا أثناء التشريح والعزل لتجنب تلف الشرايين لأن الشرايين التالفة لن تسفر بالتأكيد عن أنبوب بطاني سليم. بعد الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا للكيمياء النسيجية المناعية الثابتة مع الأجسام المضادة الفلورية أو تلطيخ الخلايا الحية للعضيات والدهون الغشائية.ستولد هذه التقنية معلومات جديدة لفهم الآليات الكامنة وراء تدفق الدم الدماغي على المستوى الأساسي لعلم وظائف الأعضاء وتحديد التحولات نحو علم الأمراض للعلاج.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

تحليل فسلجي المتداول كريات بيضاء E - Selectin بوساطة بطانة الاوعية الدموية الدقيقة في

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - tRNAs للتحليلات الوظيفية والهيكلية

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

تعيين آثار ما بعد من ثيتا انفجار تحفيز على القشرة السمعية الإنسان مع التصوير الوظيفي

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...