Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Denne forskning er blevet støttet af bevillinger fra National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 til EJB; R00HL140106 til PWP) og Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 til PWP). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Alzheimers Association.

Forsøgsdyr bør sikre, at udpeget anvendelse af dyr og tilhørende protokoller godkendes af deres Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og udføres i overensstemmelse med National Research Council's "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8. udgave, 2011) og ARRIVE-retningslinjerne. IACUC fra Loma Linda University og University of Arizona har godkendt alle protokoller, der anvendes til dette manuskript til C57BL / 6N og 3xTg-AD mus (mænd og kvinder; aldersgruppe: 2-30 måne...

<ol>
	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

Voksende beviser tyder på, at cerebrovaskulær sygdom (CVD), aldring og Alzheimers sygdom er stærkt korrelerede og er et aktuelt emne for demensforskning 4,8,14,21. Det er således indlysende, at undersøgelser af det cerebrovaskulære netværk vil have en bred indvirkning på sundheden, samtidig med at de kræver fortsat omfattende undersøgelse under sygdomsforhold. Som et væsentligt punkt...

Parenkymale arterioler leverer direkte essentiel ilt og næringsstoffer i hele hjernen1. Mens de er i grænseflade med kapillærer, reagerer stærkt vasoaktive arterioler på retrograd signalering initieret af kapillærionkanaler, der registrerer metaboliske signaler fra specifikke neuronale regioner2. Da hjerneparenkym historisk har modtaget størstedelen af undersøgelsen, er der nu opstået en rolle for endoteldysfunktion til afklaring af patologiske mekanismer forbundet med forskellige cerebrovaskulære lidelser, der ligger til grund for demens (f.eks. Iskæmisk slagtilfælde, Alzheimers sygdom)3,4,5,6 . Endotelet er integreret i perfusion af hjernen i overensstemmelse med heterogeniteten af genetik, struktur og funktion i hele vaskulære segmenter7. Pialarterier er blevet grundigt undersøgt på grund af deres relativt store størrelse, høje segmentale vaskulære resistens og rolle i blodgennemstrømningsfordelingen til det underliggende cerebrum 8,9. Således vil en bedre forståelse af arteriolære endotelmekanismer sandsynligvis forbedre forståelsen af hjernens blodgennemstrømningsregulering i sundhed og sygdom mod udviklingen af nye terapeutiske regimer.
Nye beviser fremhæver vigtigheden af at studere parenkymale arterioler i forhold til forskellige signalveje og sygdomme 8,10. Denne fremgangsmåde har imidlertid været begrænset til anvendelse af intakte trykarteriole11 og/eller kapillær-parenkymal arteriole (CaPA) præparater12. Nyligt isolerede, indfødte cerebrale arteriolære endotelceller uden andre celletyper og forvirrende faktorer er ikke blevet undersøgt, sandsynligvis på grund af tekniske vanskeligheder i deres isolation. Dette papir fremmer en tidligere teknik, der fremhæver isoleringen af pial arterielt endotel13 til nu pålideligt og reproducerbart at isolere endotelet af hjernens parenkymale arterioler (bredde: ~ 25 μm, længde: ~ 250 μm). Denne teknik hjælper med at opnå optimal opløsning af elektrisk og kemisk koblede celler i deres individuelle orientering og cellulære netværk.
Nøgleveje af interesse har inkluderet interaktionen mellem intracellulær Ca2+ ([Ca2+]i) signalering og hyperpolarisering af membranpotentiale (Vm) 14,15 - integreret i vasodilatation16 - for at tillade blod at komme ind i kapillærerne og levere ilt og næringsstoffer til aktivt parenkym17. Disse præparater muliggør elektrofysiologiske optagelser i realtid af ionkanaler, herunder Ca2+-permenante, forbigående receptorpotentiale (TRP) og K+-kanaler og/eller fluorescerende billeddannelse af intracellulære organeller i endotelcellerør under næsten fysiologiske forhold. Dette er en passende teknik for forskere, der er interesseret i fysiologiske cellulære mekanismer, der styrer endotelcellekontrol af cerebral blodgennemstrømning til hjernens parenchyma. Alt i alt vil denne teknik hjælpe forskere med bedre at forstå grundlæggende endotelsignalveje og netværkskommunikation af arterioler indlejret i hjerneparenkym, samtidig med at de behandler spørgsmål relateret til cerebrovaskulær fysiologi og patologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

Cerebral blodgennemstrømning formidles af vaskulære resistensarterier og nedstrøms parenkymale arterioler. Steady-state vaskulær resistens over for blodgennemstrømningen øges med faldende diameter fra arterier til arterioler, der i sidste ende føder ind i kapillærer. På grund af deres mindre størrelse og placering i parenchymen har arterioler været relativt underundersøgte og med mindre reproducerbarhed i fund end overfladepialarterier. Uanset hvad kræver arteriolær endotelcellestruktur og -funktion - integreret i fysiologien og ætiologien af kroniske degenerative sygdomme - omfattende undersøgelse. Især viser nye beviser, at kompromitteret endotelfunktion går forud for og forværrer kognitiv svækkelse og demens.
I parenkymal mikrocirkulation er endotel K + - kanalfunktion den mest robuste stimulus til fint at kontrollere spredningen af vasodilatation for at fremme stigninger i blodgennemstrømningen til områder med neuronal aktivitet. Dette papir illustrerer en raffineret metode til nyisolering af intakte og elektrisk koblede endotelrør (diameter, ~ 25 μm) fra musehjernens parenkymale arterioler. Arteriolære endotelrør sikres under fysiologiske forhold (37 ° C, pH 7,4) for at løse eksperimentelle variabler, der omfatter K + kanalfunktion og deres regulering, herunder intracellulær Ca2 + dynamik, ændringer i membranpotentiale og membranlipidregulering. En klar teknisk fordel i forhold til arterielt endotel er den forbedrede morfologiske opløsning af celle- og organelledimensioner (f.eks. Mitokondrier), hvilket udvider nytten af denne teknik. Sund cerebral perfusion gennem hele livet indebærer robust endotelfunktion i parenkymale arterioler, der direkte forbinder blodgennemstrømningen med brændstof til brændstof til neuronal og glial aktivitet gennem præcise anatomiske områder af hjernen. Det forventes således, at denne metode vil fremme den generelle viden om vaskulær fysiologi og neurovidenskab vedrørende den sunde og syge hjerne betydeligt.

En demonstration af protokollen er vist i figur 1 med arteriolær dissektion og endotelrørisoleringstrin som henholdsvis figur 2 og figur 3. Her blev endotelfunktionen vurderet ved at måle [Ca2+]i og Vm ved hjælp af Fura-2-fotometri og skarp elektrodeelektrofysiologi (figur 4A) som reaktion på et farmakologisk middel [2-methylthioadenosindiphosphat (MTA), en potent p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Intensiv forberedelse af intakte mus cerebrale endotelrør fra cerebrale parenkymale arterioler er illustreret til at studere cerebral blodgennemstrømningsregulering. Desuden demonstrerer vi de eksperimentelle styrker ved denne endotelundersøgelsesmodel til fluorescensbilleddannelse og elektrofysiologisk måling af vigtige cellulære signalveje, herunder ændringer i intracellulær [Ca2+] og membranpotentiale.

Isolering og funktionel analyse af arteriolært endotel af musehjernens parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Denne metode vil give bedre indsigt i funktionen af parenkymal arteriolært endotel, som direkte forbinder intracerebral blodgennemstrømning med brændstof til brændstof af neuronal og glial aktivitet i hele hjernen. En klar teknisk fordel i forhold til arteriole endotel er den forbedrede opløsning af morfologiske dimensioner og calcium og elektrisk signalering blandt individuelle intracerebrale endotelceller og deres respektive organeller. Indledningsvis vil isolering og undersøgelse af intracerebral endotel være meget udfordrende.Det er dog muligt at mestre denne teknik med masser af øvelse ledsaget af tålmodighed og dedikation. Vask den isolerede hjerne med en kold dissektionsopløsning i et bægerglas eller en petriskål for at fjerne resterende blod fra hjernens overflade. Placer den ventrale hjerneside vendt op i et kammer indeholdende kold dissektionsopløsning for at isolere parenkymale arterioler.For at isolere parenkymale arterioler skal du sikre den isolerede hjerne med stålstifter i kold dissektionsopløsning i en petriskål indeholdende mere end 50 centimeter dyb trækulinfunderet siliciumpolymerbelægning. Skær et rektangel af hjernevæv fra begge halvkugler med en skarp og justeret dissektionssaks omkring MCA'en, samtidig med at det sikres, at den øverste del af vævssegmentet er forbi forgreningspunktet fra Willis-cirklen. Fastgør hjernevævet i fadet med MCA'en opad med stålstifter.Lav forsigtigt et lavt snit nær stifterne og fjern pia med små tang, skræl forsigtigt fra den ene ende mod den anden. Fastgør forsigtigt den isolerede pia med parenkymale arterioler forgrenet fra MCA i fadet med stifterne og disseker forsigtigt de parenkymale arterioler. Afskær eventuelle resterende distale grene og sørg for, at arteriolen er ren uden væv fastgjort.Brug denne rene intakte arteriole til enzymatisk fordøjelse. Alternativt kan du skære hver arteriole i to stykker til enzymatisk fordøjelse for at forberede endotelrør, hvis det ønskes. Til delvis fordøjelse af arteriolære segmenter placeres intakte arteriolære segmenter i en milliliter dissociationsopløsning i et 10 ml glasrør indeholdende papain, dithioerythritol, collagenase og elastase.Inkuber arteriolære segmenter ved 34 grader Celsius i 10 til 12 minutter. For at isolere det arteriolære endotelrør skal du placere triturationspipetten fastgjort med mikrosprøjteinjektoren i dissociationsopløsningen i kammeret og placere den tæt på den ene ende af det fordøjede beholdersegment. Indstil en hastighed inden for området en til tre nanoliter i sekundet på pumpestyringen for skånsom trituration.Mens du opretholder 100X til 200X forstørrelse, skal du trække det arteriolære segment tilbage i pipetten og derefter injicere for at dissociere adventitia og glatte muskelceller. Triturer karsegmentet, indtil alle glatte muskelceller er dissocieret, og kun endotelceller forbliver som et intakt rør. Med mikromanipulatorer skal du sikre hver ende af endotelrøret på glasdækslerne i kammeret med borosilikatglasfastgørelsespipetter For at måle endotelmembranpotentialet, mens du ser gennem 4X-målet, skal du forsigtigt placere den skarpe elektrodespids lige over en celle i det arteriorale endotelrør i den flydende fysiologiske saltopløsning med en mikromanipulator.Forøg gradvist forstørrelsen til 400X, og flyt elektrodespidsen efter behov. Brug mikromanipulatoren til forsigtigt at indsætte spidsen af en skarp elektrode i en af cellerne i endotelrøret og begynde at optage VM ved hjælp af et elektrometer. Når endotelhvile-VM'en er stabil fra minus 30 til minus 40 millivolt, anvendes de ønskede farmakologiske midler pr. Eksperimentelt mål.Læg endotelrøret med fluorescenstrackeren til plasmamembranen eller den ønskede organel ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter. Vask cellerne med frisk superfusion fysiologisk saltopløsning og billede levende celler under mikroskopet ved excitationsbølgelængden af de respektive farvestoffer. Endotelfunktionen blev vurderet ved at måle intracellulært calcium- og membranpotentiale som reaktion på et farmakologisk middel MTA, en potent purinerg receptoragonist ved 37 grader Celsius.Ved påføring af en mikromolær MTA øges intracellulær calciumkoncentration hurtigt med en samtidig hyperpolarisering. Desuden blev det intakte endotel inkuberet ved 37 grader Celsius med fluorescerende trackere til visualisering for at undersøge cellulær morfologi. Levende endotelcellebilleddannelse viste co-farvning for plasmamembran og kerner.Plasmamembranen blev farvet sammen med en endoplasmatisk retikulum fluorescerende plet, hvorved områder med tilsyneladende overlapning af ER i nærheden af plasmamembranen fremstår orange. Eksperimentatoren skal være forsigtig under dissektion og isolering for at undgå skade på arteriolerne, fordi en beskadiget arteriole bestemt ikke vil give et intakt endotelrør. Efter proceduren kan cellerne anvendes til fast immunhistokemi med fluorescerende antistoffer eller levende cellefarvning af organeller og membranlipider.Denne teknik vil generere ny information til forståelse af mekanismer, der ligger til grund for cerebral blodgennemstrømning på det grundlæggende niveau for fysiologi og vælge overgange til patologi til terapi.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Kortlægning af eftervirkningerne af Theta brast Stimulation om den menneskelige auditive cortex med Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolation, Kultur og funktionel karakterisering af Voksen Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering og Fysiologisk Analyse af Mouse cardiomyocytter

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...