Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 an EJB; R00HL140106 bis PWP) und der Alzheimer's Association (AZRGD-21-805835 bis PWP). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder der Alzheimer's Association dar.

Experimentatoren sollten sicherstellen, dass die vorgesehene Verwendung von Tieren und die damit verbundenen Protokolle von ihrem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des National Research Council (8. Auflage, 2011) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt werden. Die IACUC der Loma Linda University und der University of Arizona hat alle Protokolle, die für dieses Manuskript verwendet werden, für C57BL...

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	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zerebrovaskuläre Erkrankungen (CVD), Altern und Alzheimer-Krankheit stark korreliert sind und ein aktuelles Thema der Demenzforschungsind 4,8,14,21. Daher ist es offensichtlich, dass Studien des zerebrovaskulären Netzwerks einen breiten Einfluss auf die Gesundheit haben würden, während sie eine fortgesetzte umfassende Untersuchung während der Kran...

Parenchymale Arteriolen liefern direkt essentiellen Sauerstoff und Nährstoffe im gesamten Gehirn1. Während der Verbindung mit Kapillaren reagieren hochvasoaktive Arteriolen auf retrograde Signale, die von Kapillarionenkanälen initiiert werden, die Stoffwechselsignale aus bestimmten neuronalen Regionen wahrnehmen2. Da das Gehirnparenchym in der Vergangenheit den Großteil der Untersuchungen erhalten hat, hat sich nun eine Rolle für die endotheliale Dysfunktion für die Klärung pathologischer Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen zerebrovaskulären Erkrankungen ergeben, die Demenz zugrunde liegen (z. B. ischämischer Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit)3,4,5,6 . Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der Perfusion des Gehirns in Übereinstimmung mit der Heterogenität von Genetik, Struktur und Funktion in den Gefäßsegmenten7. Pialarterien wurden aufgrund ihrer relativ großen Größe, ihres hohen segmentalen Gefäßwiderstands und ihrer Rolle bei der Blutflussverteilung zum darunter liegenden Großhirnumfassend untersucht 8,9. Daher wird ein besseres Verständnis der arteriolaren Endothelmechanismen wahrscheinlich das Verständnis der Blutflussregulation des Gehirns in Gesundheit und Krankheit im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Regime verbessern.
Neue Erkenntnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, parenchymale Arteriolen in Bezug auf verschiedene Signalwege und Krankheiten zu untersuchen 8,10. Dieser Ansatz beschränkte sich jedoch auf die Verwendung intakter druckbeaufschlagter Arteriolen-11- und/oder Kapillar-Parenchymal-Arteriolen-Präparate (CaPA)12. Frisch isolierte, native zerebrale arterioläre Endothelzellen, die frei von anderen Zelltypen und Störfaktoren sind, wurden nicht untersucht, wahrscheinlich aufgrund technischer Schwierigkeiten bei ihrer Isolierung. Diese Arbeit bringt eine frühere Technik voran, die die Isolierung des arteriellen Endothels13 hervorhebt, um nun das Endothel der parenchymalen Arteriolen des Gehirns zuverlässig und reproduzierbar zu isolieren (Breite: ~ 25 μm, Länge: ~ 250 μm). Diese Technik hilft, eine optimale Auflösung von elektrisch und chemisch gekoppelten Zellen in ihrer individuellen Orientierung und ihren zellulären Netzwerken zu erreichen.
Zu den wichtigsten interessanten Signalwegen gehörten die Wechselwirkung der intrazellulären Ca 2 + ([Ca2 +]i) -Signalgebung und die Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) 14,15 - integraler Bestandteil der Vasodilatation 16 -, damit Blut in die Kapillaren eindringen und Sauerstoff und Nährstoffe an aktives Parenchym 17 abgebenkann. Diese Präparate ermöglichen elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnungen von Ionenkanälen, einschließlich Ca2 +-permeant, transientem Rezeptorpotential (TRP) und K + -Kanälen und/oder fluoreszierender Bildgebung von intrazellulären Organellen in Endothelzellröhren unter nahezu physiologischen Bedingungen. Dies ist eine geeignete Technik für Forscher, die sich für physiologische zelluläre Mechanismen interessieren, die die Endothelzellkontrolle der zerebralen Blutflusslieferung an das Gehirnparenchym steuern. Insgesamt wird diese Technik den Forschern helfen, grundlegende endotheliale Signalwege und die Netzwerkkommunikation von Arteriolen, die in das Parenchym des Gehirns eingebettet sind, besser zu verstehen und gleichzeitig Fragen im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Physiologie und Pathologie zu beantworten.

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		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

Der zerebrale Blutfluss wird durch vaskuläre Widerstandsarterien und nachgeschaltete parenchymale Arteriolen gefördert. Der stationäre Gefäßwiderstand gegen den Blutfluss nimmt mit abnehmendem Durchmesser von den Arterien zu den Arteriolen zu, die letztendlich in die Kapillaren münden. Aufgrund ihrer geringeren Größe und Lage im Parenchym wurden Arteriolen relativ wenig untersucht und mit geringerer Reproduzierbarkeit der Befunde als oberflächliche Piialarterien. Unabhängig davon erfordert die Struktur und Funktion der arteriolaren Endothelzellen - integraler Bestandteil der Physiologie und Ätiologie chronischer degenerativer Erkrankungen - umfangreiche Untersuchungen. Insbesondere zeigen neue Erkenntnisse, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion kognitiven Beeinträchtigungen und Demenz vorausgeht und diese verschlimmert.
In der parenchymalen Mikrozirkulation ist die endotheliale K + - Kanalfunktion der robusteste Reiz, um die Ausbreitung der Vasodilatation fein zu kontrollieren, um die Erhöhung des Blutflusses in Bereiche der neuronalen Aktivität zu fördern. Diese Arbeit veranschaulicht eine verfeinerte Methode zur frischen Isolierung intakter und elektrisch gekoppelter endothelialer "Röhren" (Durchmesser, ~ 25 μm) aus parenchymalen Arteriolen des Mausgehirns. Arterioläre Endothelröhren werden unter physiologischen Bedingungen (37 °C, pH 7,4) gesichert, um experimentelle Variablen aufzulösen, die die K+- Kanalfunktion und deren Regulation umfassen, einschließlich intrazellulärer Ca2+- Dynamik, Veränderungen des Membranpotentials und Membranlipidregulation. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem arteriellen Endothel ist die verbesserte morphologische Auflösung der Zell- und Organellendimensionen (z. B. Mitochondrien), was die Nützlichkeit dieser Technik erweitert. Eine gesunde zerebrale Perfusion während des gesamten Lebens beinhaltet eine robuste Endothelfunktion in parenchymalen Arteriolen, die den Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität in präzisen anatomischen Regionen des Gehirns verbindet. Es wird daher erwartet, dass diese Methode das allgemeine Wissen über Gefäßphysiologie und Neurowissenschaften in Bezug auf das gesunde und kranke Gehirn erheblich voranbringen wird.

Eine Demonstration des Protokolls ist in Abbildung 1 mit arteriolaren Dissektions- und Endothelröhrenisolationsschritten als Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Hier wurde die Endothelfunktion durch Messung von [Ca2+]i und Vm mittels Fura-2-Photometrie und Elektrophysiologie der scharfen Elektrode (Abbildung 4A) als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff [...

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Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Diese Methode wird einen besseren Einblick in die Funktion des parenchymalen arteriolaren Endothels geben, das den intrazerebralen Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität im gesamten Gehirn verbindet. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem Arteriolendothel ist die verbesserte Auflösung der morphologischen Dimensionen und der Kalzium- und elektrischen Signalübertragung zwischen einzelnen intrazerebralen Endothelzellen und ihren jeweiligen Organellen. Zunächst wird die Isolierung und Untersuchung des intrazerebralen Endothels sehr schwierig sein.Es ist jedoch möglich, diese Technik mit viel Übung zu meistern, begleitet von Geduld und Hingabe. Waschen Sie das isolierte Gehirn mit einer kalten Dissektionslösung in einem Becherglas oder einer Petrischale, um das restliche Blut von der Oberfläche des Gehirns zu entfernen. Legen Sie die ventrale Gehirnseite nach oben in eine Kammer, die kalte Dissektionslösung enthält, um parenchymale Arteriolen zu isolieren.Um parenchymale Arteriolen zu isolieren, sichern Sie das isolierte Gehirn mit Stahlstiften in kalter Dissektionslösung in einer Petrischale, die mehr als 50 Zentimeter tiefe mit Holzkohle angereicherte Siliziumpolymerbeschichtung enthält. Schneiden Sie ein Rechteck aus Hirngewebe aus beiden Hemisphären mit einer scharfen und ausgerichteten Sezierschere um die MCA herum, während Sie sicherstellen, dass der obere Teil des Gewebesegments hinter dem Verzweigungspunkt vom Kreis von Willis liegt. Befestigen Sie das Hirngewebe in der Schale mit dem MCA nach oben mit Stahlstiften.Machen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt in der Nähe der Stifte und entfernen Sie die Pia mit einer kleinen Pinzette, die sich vorsichtig von einem Ende zum anderen schält. Sichern Sie vorsichtig die isolierte Pia mit parenchymalen Arteriolen, die von MCA verzweigt sind, in der Schale mit den Stiften und sezieren Sie vorsichtig die parenchymalen Arteriolen. Schneiden Sie alle verbleibenden distalen Äste ab und stellen Sie sicher, dass die Arteriole sauber ist und kein Gewebe anhaftet.Verwenden Sie diese saubere, intakte Arteriole für die enzymatische Verdauung. Alternativ können Sie jede Arteriole für die enzymatische Verdauung in zwei Stücke schneiden, um auf Wunsch Endothelröhren vorzubereiten. Für die partielle Verdauung von Arteriolsegmenten legen Sie intakte Arteriolsegmente in einen Milliliter Dissoziationslösung in einem 10-Milliliter-Glasröhrchen, das Papain, Dithioerythrit, Kollagenase und Elastase enthält.Inkubieren Sie Arteriolsegmente bei 34 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten. Um den arteriolaren Endothelschlauch zu isolieren, legen Sie die mit dem Mikrospritzeninjektor befestigte Verreibungspipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßsegments. Stellen Sie eine Rate im Bereich von ein bis drei Nanolitern pro Sekunde auf dem Pumpenregler für eine schonende Verreibung ein.Unter Beibehaltung einer 100-fachen bis 200-fachen Vergrößerung ziehen Sie das Arteriolärsegment in die Pipette zurück und injizieren Sie dann, um die Adventitia- und glatten Muskelzellen zu dissoziieren. Trituieren Sie das Gefäßsegment, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und nur noch Endothelzellen als intaktes Rohr übrig bleiben. Mit Mikromanipulatoren befestigen Sie jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckel in der Kammer mit Borosilikatglas-Pinning-Pipetten Um das Endothelmembranpotential zu messen, positionieren Sie beim Betrachten durch das 4X-Objektiv vorsichtig die scharfe Elektrodenspitze knapp über einer Zelle des arteriolaren Endothelrohrs in die fließende physiologische Salzlösung mit einem Mikromanipulator.Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu. Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen des Endothelrohrs ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der VM mit einem Elektrometer. Sobald die endotheliale ruhende VM von minus 30 bis minus 40 Millivolt stabil ist, wenden Sie die gewünschten pharmakologischen Wirkstoffe pro Versuchsziel an.Laden Sie das Endothelrohr mit dem Fluoreszenz-Tracker für die Plasmamembran oder die gewünschte Organelle bei 37 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit frischer physiologischer Superfusionssalzlösung und bilden Sie lebende Zellen unter dem Mikroskop bei der Anregungswellenlänge der jeweiligen Farbstoffe ab. Die Endothelfunktion wurde durch Messung des intrazellulären Kalzium- und Membranpotentials als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff MTA, einen potenten purinergen Rezeptoragonisten bei 37 Grad Celsius, beurteilt.Bei Anwendung eines mikromolaren MTA steigt die intrazelluläre Calciumkonzentration bei gleichzeitiger Hyperpolarisation schnell an. Darüber hinaus wurde das intakte Endothel bei 37 Grad Celsius mit fluoreszierenden Trackern zur Visualisierung zur Untersuchung der Zellmorphologie inkubiert. Live-Endothelzellbildgebung zeigte eine Co-Färbung für Plasmamembran und Kerne.Die Plasmamembran wurde zusammen mit einer endoplasmatischen Retikulumfluoreszenzfärbung gefärbt, wodurch Bereiche mit scheinbarer Überlappung der Notaufnahme in der Nähe der Plasmamembran orange erscheinen. Der Experimentator sollte während der Dissektion und Isolierung vorsichtig sein, um Schäden an den Arteriolen zu vermeiden, da eine beschädigte Arteriole definitiv keinen intakten Endothelschlauch ergibt. Nach dem Verfahren können die Zellen für die fixierte Immunhistochemie mit fluoreszierenden Antikörpern oder für die Färbung lebender Zellen von Organellen und Membranlipiden verwendet werden.Diese Technik wird neue Informationen zum Verständnis der Mechanismen generieren, die dem zerebralen Blutfluss auf der grundlegenden Ebene für die Physiologie zugrunde liegen, und Übergänge in Richtung Pathologie für die Therapie auswählen.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Forschung

Biologie

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Kartierung der Nachwirkungen der Theta Burst Stimulation auf das menschliche Gehör Cortex mit Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...