Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R00AG047198 & R56AG062169 ל- EJB; R00HL140106 ל- PWP) ואיגוד האלצהיימר (AZRGD-21-805835 ל- PWP). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות או האגודה לאלצהיימר.

על הנסיינים לוודא כי שימוש ייעודי בבעלי חיים ובפרוטוקולים הקשורים אליהם יאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ויבוצע בהתאם ל"מדריך הטיפול והשימוש בחיות מעבדה" של מועצת המחקרהלאומית ( מהדורה 8, 2011) והנחיות ARRIVE. IACUC של אוניברסיטת לומה לינדה ואוניברסיטת אריזונה אישר ?...

<ol>
	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמחלות כלי דם במוח (CVD), הזדקנות ומחלת אלצהיימר קשורות קשר הדוק והן נושא נוכחי של מחקר דמנציה 4,8,14,21. לכן, ברור כי מחקרים של רשת כלי הדם במוח תהיה השפעה רחבה על הבריאות תוך דרישת המשך חקירה ...

עורקי Parenchymal ישירות לספק חמצן חיוני וחומרים מזינים ברחבי המוח1. תוך כדי התממשקות עם נימים, arterioles vasoactive מאוד להגיב איתות מדרדר ביוזמת ערוצי יון נימי לחוש אותות מטבוליים מאזורים עצביים ספציפיים2. עם parenchyma המוח לאחר שקיבלה היסטורית את עיקר החקירה, תפקיד לתפקוד לקוי של אנדותל התפתח כעת להבהרת מנגנונים פתולוגיים הקשורים להפרעות שונות בכלי הדם במוח שבבסיס דמנציה (למשל, שבץ איסכמי, מחלת אלצהיימר)3,4,5,5,6 . האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מהזלוף של המוח בהתאם להטרוגניות של גנטיקה, מבנה ותפקוד בכל מגזרי כלי הדם7. עורקי פיאל נחקרו בהרחבה בשל גודלם הגדול יחסית, עמידות גבוהה של כלי דם מגזריים, ותפקידם בהתפלגות זרימת הדם למוח המוח הבסיסי 8,9. לכן, הבנה טובה יותר של מנגנוני אנדותל arteriolar סביר להניח לשפר את ההבנה של ויסות זרימת הדם במוח בבריאות ומחלות לקראת התפתחות של משטרים טיפוליים חדשניים.
ראיות המתעוררות מדגיש את החשיבות של לימוד עורקים parenchymal ביחס מסלולי איתות שונים ומחלות 8,10. עם זאת, גישה זו הוגבלה לשימוש בעורק בלחץ שלם11 ו/או נימי-parenchymal arteriole (CaPA)הכנות 12. מבודדים טריים, תאי אנדותל מוחיים מקומיים נטולי סוגי תאים אחרים וגורמים מבלבלים לא נבדקו, ככל הנראה בשל קשיים טכניים בבידודם. נייר זה מקדם טכניקה קודמת המדגישה את הבידוד של אנדותל עורקי פיאלי13 כדי כעת לבודד באופן אמין ורבייה את האנדותל של עורקי פרנצ'ימל במוח (רוחב: ~ 25 מיקרומטר, אורך: ~ 250 מיקרומטר). טכניקה זו מסייעת להשיג רזולוציה אופטימלית של תאים מצמידים חשמלית וכימית באוריינטציה האישית שלהם וברשתות הסלולריות שלהם.
נתיבים מרכזיים של עניין כללו את האינטראקציה של Ca2+ תאיים ([Ca2+]i) איתות והיפר-קוטביזציה של פוטנציאל הממברנה (Vm)14,15 – אינטגרלי להתרחבות כלי דם16 – כדי לאפשר לדם להיכנס לנימים ולספק חמצן וחומרים מזינים לפרנצ'ימהפעילה 17. תכשירים אלה מאפשרים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בזמן אמת של ערוצי יונים, כולל Ca2 + -permeant, פוטנציאל קולטן חולף (TRP) ו- K + ערוצים ו / או הדמיה פלואורסצנטית של אברונים תאיים בתוך צינורות תא אנדותל בתנאים כמעט פיזיולוגיים. זוהי טכניקה מתאימה לחוקרים המעוניינים במנגנונים תאיים פיזיולוגיים השולטים בשליטה בתאי אנדותל על אספקת זרימת הדם המוחית לפרנצ'ימה במוח. בסך הכל, טכניקה זו תסייע לחוקרים להבין טוב יותר מסלולי איתות אנדותל בסיסיים ותקשורת רשת של עורקים המוטמעים בפרנצ'ימה במוח תוך התייחסות לשאלות הקשורות לפיזיולוגיה ופתולוגיה של כלי הדם במוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

זרימת הדם המוחית מועברת על ידי עורקי התנגדות כלי דם ועורקים פרנצ'ימליים במורד הזרם. עמידות כלי דם במצב יציב לזרימת הדם עולה עם קוטר פוחת מעורקים לעורקים שבסופו של דבר ניזונים לנימים. בשל גודלם הקטן יותר ומיקומם בפרנצ'ימה, arterioles כבר understudied יחסית עם פחות רבייה בממצאים מאשר עורקי pial פני השטח. כך או כך, מבנה ותפקוד תאי אנדותל אנדותל עורקיים – חלק בלתי נפרד מהפיזיולוגיה והאטיולוגיה של מחלות ניווניות כרוניות – דורשים חקירה מקיפה. בפרט, ראיות המתעוררות מדגימות כי תפקוד אנדותל נפגע מקדים ומחריף פגיעה קוגניטיבית ודמנציה.
במיקרו-סירקולציה parenchymal, פונקציית ערוץ K + אנדותל הוא הגירוי החזק ביותר כדי לשלוט דק על התפשטות vasodilation כדי לקדם את העליות בזרימת הדם לאזורים של פעילות עצבית. מאמר זה ממחיש שיטה מעודנת לבידוד טרי של "צינורות" אנדותל שלמים ומצמידים חשמלית (קוטר, ~ 25 מיקרומטר) מעורקי מפרקי מוח העכבר. צינורות אנדותל Arteriolar מאובטחים במהלך תנאים פיזיולוגיים (37 °C, pH 7.4) כדי לפתור משתנים ניסיוניים המקיפים פונקציית ערוץ K + ואת הרגולציה שלהם, כולל דינמיקה Ca2 + תאיים, שינויים בפוטנציאל הממברנה, ויסות השומנים הממברנה. יתרון טכני מובהק לעומת אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המורפולוגית המשופרת של ממדי התא והאברונל (למשל, המיטוכונדריה), המרחיבה את התועלת של טכניקה זו. זלוף מוחי בריא לאורך החיים כרוך בתפקוד אנדותל חזק בעורקים פרנצ'ימליים, המקשר ישירות את זרימת הדם לתדלוק של פעילות עצבית וגליאלית בכל האזורים האנטומיים המדויקים של המוח. לכן, צפוי כי שיטה זו תקדם באופן משמעותי את הידע הכללי של פיזיולוגיה של כלי הדם ומדעי המוח לגבי המוח הבריא והחולני.

הדגמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1 עם ניתוח עורקי וצעדי בידוד צינור אנדותל כאיור 2 ואיור 3, בהתאמה. כאן, תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידה [Ca2+]i ו- Vm באמצעות פוטומטריה Fura-2 ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה (איור 4A) בת?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

שיטה זו תספק תובנה טובה יותר על תפקודו של אנדותל עורקי parenchymal אשר מקשר ישירות את זרימת הדם התוך מוחית לתדלוק של פעילות עצבית גליה ברחבי המוח. יתרון טכני מובהק על פני אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המשופרת של ממדים מורפולוגיים ואיתות סידן וחשמלי בקרב תאי אנדותל תוך-מוחיים בודדים והאברונים שלהם. בתחילה, בידוד ובדיקה של אנדותל תוך מוחי יהיה מאתגר מאוד.עם זאת, ניתן לשלוט בטכניקה זו עם שפע של תרגול מלווה סבלנות ומסירות. לשטוף את המוח המבודד עם פתרון ניתוח קר בכוס או צלחת פטרי כדי להסיר את הדם הנותר מפני השטח של המוח. מניחים את צד המוח הגחוני פונה כלפי מעלה בתא המכיל פתרון חתך קר כדי לבודד עורקים parenchymal.כדי לבודד עורקים פרנצ'ימליים, אבטחו את המוח המבודד עם סיכות פלדה בתמיסת ביתור קרה בצלחת פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימרי בעומק של יותר מ-50 ס"מ. חותכים מלבן של רקמת המוח משתי ההמיספרות עם מספריים חדים ומקושרים סביב ה- MCA תוך הבטחה כי החלק העליון של קטע הרקמה הוא בעבר נקודת ההסתעפות ממעגל ויליס. אבטחו את רקמת המוח לתוך הצלחת עם MCA פונה כלפי מעלה עם סיכות פלדה.בזהירות לעשות חתך רדוד ליד הסיכות ולהסיר את פיא עם מלקחיים קטנים, בעדינות קילוף מקצה אחד לכיוון השני. בזהירות לאבטח את פיה מבודד עם arterioles parenchymal הסתעף מ MCA בצלחת עם הסיכות ולנתח בזהירות את arterioles parenchymal. חותכים את כל הענפים הדיסטליים הנותרים ומוודאים שהעורקים נקיים ללא רקמות מחוברות.השתמש זה עורק שלם נקי לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל arteriole לשני חלקים לעיכול אנזימטי להכין צינורות אנדותל אם תרצה. לעיכול חלקי של מקטעים arteriolar, למקם מקטעים arteriolar שלמים לתוך מיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה בצינור זכוכית 10 מיליליטר המכיל פפאין, dithioerythritol, collagenase, ואלסטאז.מגזרי דלקת עורקים דגירה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות. כדי לבודד את צינור אנדותל arteriolar, למקם את פיפטה trituration מחובר עם מזרק מיקרו בתמיסת הדיסוציאציה בתא ומקם אותו קרוב לקצה אחד של קטע כלי מעוכל. הגדר קצב בטווח של ננו-ליטר אחד עד שלושה ננו-ליטרים לשניה בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, הסר את מקטע העורקים לתוך הפיפטה ולאחר מכן הזריק כדי לנתק את ההרפתקנטיה ולהחליק את תאי השריר. הפוך את מקטע הכלי לטריטורלי עד שכל תאי השריר החלקים יתנתקו ורק תאי אנדותל יישארו כצינור שלם. עם מיקרו מניפולטורים, לאבטח כל קצה של צינור אנדותל על מכסה הזכוכית בתא עם זכוכית borosilicate הצמדת פיפטות כדי למדוד את פוטנציאל קרום אנדותל, תוך כדי צפייה דרך המטרה 4X, בזהירות למקם את קצה האלקטרודה החדה רק מעל תא של צינור אנדותל arteriolar לתוך פתרון מלח פיזיולוגי זורם עם מניפולטור מיקרו.הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400X ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך. באמצעות מניפולטור מיקרו, בעדינות להכניס את הקצה של אלקטרודה חדה לתוך אחד התאים של צינור אנדותל ולהתחיל להקליט VM באמצעות אלקטרומטר. לאחר VM מנוחה אנדותל יציב ממינוס 30 למינוס 40 מיליוולט, להחיל את הסוכנים הפרמקולוגיים הרצויים לכל מטרה ניסיונית.טען את צינור האנדותל עם גשש פלואורסצנטיות עבור קרום הפלזמה או אברון הרצוי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות. לשטוף את התאים עם תמיסת מלח פיזיולוגית superfusion טרי ותאים חיים תמונה מתחת למיקרוסקופ על אורך גל עירור של הצבעים המתאימים. תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידת סידן תאי ופוטנציאל ממברנה בתגובה סוכן פרמקולוגי MTA, אגוניסט קולטן פורינרגי חזק ב 37 מעלות צלזיוס.עם יישום של MTA מיקרומולרי אחד, ריכוז סידן תאי עולה במהירות עם היפרפולריזציה בו זמנית. יתר על כן, האנדותל השלם היה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם גששים פלואורסצנטיים להדמיה כדי לבחון מורפולוגיה תאית. הדמיית תאי אנדותל חיה הראתה כתמים משותפים עבור קרום פלזמה וגרעינים.קרום הפלזמה היה מוכתם יחד עם כתם פלואורסצנטי רטיקולום אנדופלסמי לפיו אזורים של חפיפה לכאורה של ER בסמיכות של קרום הפלזמה נראים כתומים. הנסיין צריך להיות זהיר במהלך ניתוח ובידוד כדי למנוע נזק arterioles כי arterioles פגום בהחלט לא להניב צינור אנדותל שלם. בעקבות ההליך, התאים עשויים לשמש אימונוהיסטוכימיה קבועה עם נוגדנים פלואורסצנטיים או כתמי תאים חיים של אברונים ושומנים ממברנה.טכניקה זו תיצור מידע חדש להבנת מנגנונים העומדים בבסיס זרימת הדם המוחית ברמה הבסיסית לפיזיולוגיה ובחירת מעברים לפתולוגיה לטיפול.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

מיפוי לאחר הלוואי של תטא Burst גירוי בקורטקס השמיעתי האנושי בהדמיה תפקודית

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...