Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Denna forskning har fått stöd av bidrag från National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 till EJB; R00HL140106 till PWP) och Alzheimers Association (AZRGD-21-805835 till PWP). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller Alzheimers Association.

Försöksdjur bör se till att utsedd användning av djur och tillhörande protokoll godkänns av deras institutionella djurvårds- och användningskommitté (IACUC) och utförs i enlighet med National Research Councils "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8: e upplagan, 2011) och ARRIVE-riktlinjerna. IACUC vid Loma Linda University och University of Arizona har godkänt alla protokoll som används för detta manuskript för C57BL / 6N och 3xTg-AD möss (män och kvinnor; åldersinterva...

<ol>
	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

Växande bevis tyder på att cerebrovaskulär sjukdom (CVD), åldrande och Alzheimers sjukdom är starkt korrelerade och är ett aktuellt ämne för demensforskning 4,8,14,21. Således är det uppenbart att studier av det cerebrovaskulära nätverket skulle ha en bred inverkan på hälsan samtidigt som det krävs fortsatt omfattande undersökningar under sjukdomsförhållanden. Som en viktig pu...

Parenkymala arterioles levererar direkt essentiellt syre och näringsämnen i hela hjärnan1. Vid samverkan med kapillärer svarar mycket vasoaktiva arterioler på retrograd signalering initierad av kapillärjonkanaler som känner av metaboliska signaler från specifika neuronala regioner2. Med hjärnparenkym som historiskt har fått huvuddelen av undersökningen har en roll för endoteldysfunktion nu uppstått för att klargöra patologiska mekanismer associerade med olika cerebrovaskulära störningar som ligger till grund för demens (t.ex. ischemisk stroke, Alzheimers sjukdom)3,4,5,6 . Endotelet är integrerat i perfusion av hjärnan i enlighet med heterogeniteten hos genetik, struktur och funktion i hela vaskulära segment7. Pialartärer har studerats i stor utsträckning på grund av deras relativt stora storlek, höga segmentella vaskulära resistens och roll i blodflödesfördelningen till den underliggande storhjärnan 8,9. Således kommer en bättre förståelse av arteriolär endotelmekanismer sannolikt att öka förståelsen för hjärnans blodflödesreglering i hälsa och sjukdom mot utvecklingen av nya terapeutiska regimer.
Nya bevis belyser vikten av att studera parenkymala arterioles i förhållande till olika signalvägar och sjukdomar 8,10. Detta tillvägagångssätt har emellertid begränsats till användning av intakta trycksatta arteriole11 och/eller kapillärparenkymala arterioleparat (CaPA)12. Nyisolerade, inhemska cerebrala arteriolära endotelceller utan andra celltyper och förvirrande faktorer har inte undersökts, sannolikt på grund av tekniska svårigheter i deras isolering. Detta dokument främjar en tidigare teknik som belyser isoleringen av pial arteriell endotel13 för att nu på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt isolera endotelet i hjärnans parenkymala arterioler (bredd: ~ 25 μm, längd: ~ 250 μm). Denna teknik hjälper till att uppnå optimal upplösning av elektriskt och kemiskt kopplade celler i deras individuella orientering och cellulära nätverk.
Viktiga vägar av intresse har inkluderat interaktionen mellan intracellulär Ca2+ ([Ca2+]i) signalering och hyperpolarisering av membranpotential (Vm)14,15 - integrerad i vasodilatation16 - för att tillåta blod att komma in i kapillärerna och leverera syre och näringsämnen till aktivt parenkym17. Dessa preparat möjliggör elektrofysiologiska registreringar i realtid av jonkanaler, inklusive Ca2+-permeant, transient receptorpotential (TRP) och K+-kanaler och/eller fluorescerande avbildning av intracellulära organeller i endotelcellsrör under nära fysiologiska förhållanden. Detta är en lämplig teknik för forskare som är intresserade av fysiologiska cellulära mekanismer som styr endotelcellskontroll av cerebral blodflödesleverans till hjärnparenkymen. Sammantaget kommer denna teknik att hjälpa forskare att bättre förstå grundläggande endotelsignalvägar och nätverkskommunikation av arterioles inbäddade i hjärnparenkym samtidigt som man tar itu med frågor relaterade till cerebrovaskulär fysiologi och patologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

Cerebralt blodflöde förmedlas av vaskulära resistensartärer och nedströms parenkymala arterioles. Steady-state vaskulär resistens mot blodflödet ökar med minskande diameter från artärer till arterioler som i slutändan matar in i kapillärer. På grund av deras mindre storlek och placering i parenkymen har arterioles varit relativt understuderade och med mindre reproducerbarhet i fynd än ytpialartärer. Oavsett, arteriolär endotelcellstruktur och funktion - integrerad i fysiologin och etiologin för kroniska degenerativa sjukdomar - kräver omfattande undersökning. I synnerhet visar nya bevis att komprometterad endotelfunktion föregår och förvärrar kognitiv försämring och demens.
I den parenkymala mikrocirkulationen är endotelial K + -kanalfunktion den mest robusta stimulansen för att fint kontrollera spridningen av vasodilatation för att främja ökningar av blodflödet till områden med neuronal aktivitet. Detta dokument illustrerar en förfinad metod för att nyligen isolera intakta och elektriskt kopplade endoteliala "rör" (diameter, ~ 25 μm) från mushjärnparenkymala arterioler. Arteriolära endotelrör säkras under fysiologiska förhållanden (37 ° C, pH 7,4) för att lösa experimentella variabler som omfattar K + -kanalfunktion och deras reglering, inklusive intracellulär Ca2 + - dynamik, förändringar i membranpotential och membranlipidreglering. En distinkt teknisk fördel jämfört med arteriell endotel är den förbättrade morfologiska upplösningen av cell- och organelldimensioner (t.ex. mitokondrier), vilket utökar användbarheten av denna teknik. Hälsosam cerebral perfusion under hela livet medför robust endotelfunktion i parenkymala arterioles, som direkt kopplar blodflödet till bränslet av neuronal och glial aktivitet i hela exakta anatomiska regioner i hjärnan. Således förväntas det att denna metod avsevärt kommer att främja den allmänna kunskapen om vaskulär fysiologi och neurovetenskap om den friska och sjuka hjärnan.

En demonstration av protokollet visas i figur 1 med arteriolär dissektion och endotelrörsisoleringssteg som figur 2 respektive figur 3. Här bedömdes endotelfunktionen genom att mäta [Ca2+]i och Vm med hjälp av Fura-2 fotometri och skarp elektrodelektrofysiologi (figur 4A) som svar på ett farmakologiskt medel [2-metyltioadenosindifosfat (MTA), en potent purinerg re...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Intensiv beredning av intakta mus cerebral endoteliala "rör" från cerebral parenkymala arterioler illustreras för att studera cerebral blodflödesreglering. Vidare demonstrerar vi de experimentella styrkorna hos denna endotelstudiemodell för fluorescensavbildning och elektrofysiologisk mätning av viktiga cellulära signalvägar, inklusive förändringar i intracellulär [Ca2+] och membranpotential.

Isolering och funktionell analys av arteriolär endotel av mushjärnparenkym

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Denna metod kommer att ge bättre inblick i funktionen av parenkymalt arteriolär endotel som direkt kopplar intracerebralt blodflöde till bränslet av neuronal och glial aktivitet i hela hjärnan. En distinkt teknisk fördel jämfört med arteriole endotel är den förbättrade upplösningen av morfologiska dimensioner och kalcium och elektrisk signalering bland enskilda intracerebral endotelceller och deras respektive organeller. Initialt kommer isolering och undersökning av intracerebral endotel att vara mycket utmanande.Det är dock möjligt att behärska denna teknik med mycket övning åtföljd av tålamod och engagemang. Tvätta den isolerade hjärnan med en kall dissektionslösning i en bägare eller petriskål för att ta bort kvarvarande blod från hjärnans yta. Placera den ventrala hjärnsidan uppåt i en kammare som innehåller kall dissektionslösning för att isolera parenkymala arterioler.För att isolera parenkymala arterioler, säkra den isolerade hjärnan med stålstift i kall dissektionslösning i en petriskål som innehåller mer än 50 centimeter djup kolinfunderad kiselpolymerbeläggning. Skär en rektangel av hjärnvävnad från båda halvkloten med skarpa och inriktade dissektionssaxar runt MCA samtidigt som du ser till att den övre delen av vävnadssegmentet är förbi förgreningspunkten från Willis cirkel. Säkra hjärnvävnaden i skålen med MCA vänd uppåt med stålstift.Gör försiktigt ett grunt snitt nära stiften och ta bort pia med små pincett, försiktigt skala från ena änden mot den andra. Säkra försiktigt den isolerade pia med parenkymala arterioler grenade från MCA i skålen med stiften och dissekera försiktigt parenkymala arterioler. Klipp av eventuella återstående distala grenar och se till att arteriolen är ren utan att någon vävnad är fäst.Använd denna rena intakta arteriole för enzymatisk matsmältning. Alternativt skär varje arteriole i två delar för enzymatisk matsmältning för att förbereda endotelrör om så önskas. För partiell matsmältning av arteriolära segment, placera intakta arteriolära segment i en milliliter dissociationslösning i ett 10 ml glasrör innehållande papain, dithioerytritol, kollagenas och elastas.Inkubera arteriolära segment vid 34 grader Celsius i 10 till 12 minuter. För att isolera det arteriolära endotelröret, placera triturationspipetten fäst med mikrosprutainjektorn i dissociationslösningen i kammaren och placera den nära ena änden av det smälta kärlsegmentet. Ställ in en hastighet inom intervallet en till tre nanoliter per sekund på pumpregulatorn för skonsam triturering.Medan du behåller 100X till 200X förstoring, dra tillbaka det arteriolära segmentet i pipetten och injicera sedan för att dissociera adventitia och glattmuskelceller. Triturera kärlsegmentet tills alla glatta muskelceller är dissocierade och endast endotelceller förblir som ett intakt rör. Med mikromanipulatorer, säkra varje ände av endotelröret på glasöverdraget i kammaren med borosilikatglasnålpipetter För att mäta endotelmembranpotentialen, medan du tittar genom 4X-målet, placera försiktigt den skarpa elektrodspetsen strax över en cell i det arteriolära endotelröret i den flytande fysiologiska saltlösningen med en mikromanipulator.Öka gradvis förstoringen till 400X och flytta elektrodspetsen efter behov. Använd mikromanipulatorn och sätt försiktigt in spetsen på en skarp elektrod i en av cellerna i endotelröret och börja spela in VM med en elektrometer. När endotelvilans VM är stabil från minus 30 till minus 40 millivolt, applicera de önskade farmakologiska medlen per experimentellt mål.Ladda endotelröret med fluorescensspåraren för plasmamembranet eller önskad organell vid 37 grader Celsius i 15 till 30 minuter. Tvätta cellerna med färsk superfusion fysiologisk saltlösning och avbilda levande celler under mikroskopet vid excitationsvåglängden för respektive färgämnen. Endotelfunktionen bedömdes genom mätning av intracellulär kalcium- och membranpotential som svar på ett farmakologiskt medel MTA, en potent purinerg receptoragonist vid 37 grader Celsius.Vid applicering av en mikromolär MTA ökar intracellulär kalciumkoncentration snabbt med en samtidig hyperpolarisering. Vidare inkuberades det intakta endotelet vid 37 grader Celsius med fluorescerande spårare för visualisering för att undersöka cellulär morfologi. Levande endotelcellsavbildning visade samfärgning för plasmamembran och kärnor.Plasmamembranet färgades tillsammans med en endoplasmatisk retikulumfluorescerande fläck varigenom områden med uppenbar överlappning av ER i närheten av plasmamembranet verkar orange. Experimenteraren bör vara försiktig under dissektion och isolering för att undvika skador på arteriolerna eftersom en skadad arteriole definitivt inte kommer att ge ett intakt endotelrör. Efter proceduren kan cellerna användas för fast immunohistokemi med fluorescerande antikroppar eller levande cellfärgning av organeller och membranlipider.Denna teknik kommer att generera ny information för att förstå mekanismer som ligger till grund för cerebralt blodflöde på grundläggande nivå för fysiologi och välja övergångar mot patologi för terapi.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Analys av Fysiologiska E-selektin-medierad Leukocyt rullar på Microvascular endotelet

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissekering av hippocampus dentate gyrus från vuxen mus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Isolering av Översätta Ribosomer Med peptidyl-tRNAs för funktionella och strukturella analyser

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Kartläggning av efterverkningarna av Theta skurstimuleringen om den mänskliga hörselbarken med funktionella Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolering, kultur, och funktionell karakterisering av vuxen mus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering och fysiologisk Analys av Mus Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...