Name: isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma
Uploaded: 2022-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R00AG047198 & R56AG062169) EJB'ye; R00HL140106'dan PWP'ye) ve Alzheimer Derneği (AZRGD-21-805835'ten PWP'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Alzheimer Derneği'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Deneyciler, belirlenmiş hayvan kullanımının ve ilgili protokollerin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmasını ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" (8. Baskı, 2011) ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmesini sağlamalıdır. Loma Linda Üniversitesi IACUC ve Arizona Üniversitesi, C57BL/6N ve 3xTg-AD fareleri (erkekler ve kadınlar; yaş aralığı: 2-30 ay) için bu makale i...

<ol>
	<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Kelleher, R. J., Soiza, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+endothelial+dysfunction+in+the+development+of+Alzheimer's+disease:+Is+Alzheimer's+a+vascular+disorder.">Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder.</a> American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Alzheimer's+disease+progressively+alters+sex-dependent+KCa+and+sex-independent+KIR+channel+function+in+cerebrovascular+endothelium.">Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium.</a> Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).</li><li>Pires, P. W., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+TRPA1+channels+in+the+cerebral+endothelium+following+ischemic+stroke.">Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke.</a> elife. 7, 35316 (2018).</li><li>Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+improves+cerebral+blood+flow+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Function. 2 (2), (2021).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologically+reversible+zonation-dependent+endothelial+cell+transcriptomic+changes+with+neurodegenerative+disease+associations+in+the+aged+brain.">Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain.</a> Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).</li><li>Peters, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+disrupts+unitary+calcium+entry+through+endothelial+NMDA+receptors+in+mouse+cerebral+arteries.">Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles+with+aging:+Role+of+rho+kinase+2+and+impact+of+genetic+background.">Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+depolarizes+hippocampal+arterioles+to+restore+myogenic+tone+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cannulation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).</li><li>Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+pressurized+hippocampal+capillary-parenchymal+arteriole+preparation+for+functional+study.">Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+intracellular+calcium+and+membrane+potential+in+freshly+isolated+and+intact+mouse+cerebral+endothelium.">Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).</li><li>Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+alters+cerebrovascular+endothelial+GPCR+and+K++channel+function:+Divergent+role+of+biological+sex.">Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex.</a> Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).</li><li>Behringer, E. J., Hakim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+among+KCa+and+TRP+channels+for+cardiovascular+physiology:+Modern+perspectives+on+aging+and+chronic+disease.">Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SKCa+and+IKCa+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).</li><li>Hakim, M. A., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-beta-cyclodextrin+restores+KIR+channel+function+in+brain+endothelium+of+female+Alzheimer's+disease+Mice.">Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice.</a> Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).</li><li>Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+impairs+electrical+conduction+along+endothelium+of+resistance+arteries+through+enhanced+Ca2+-activated+K++channel+activation.">Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).</li><li>Attems, J., Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overlap+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease--lessons+from+pathology.">The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology.</a> BMC Medicine. 12, 206 (2014).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice.">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).</li><li>Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+genetically+encoded+voltage+indicators.">Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators.</a> Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).</li><li>Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane+in+the+healthy+and+pathological+brain.">The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain.</a> Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> elife. 9, 51413 (2020).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+endothelial+cells+are+exquisite+sensors+of+age-related+circulatory+cues.">Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues.</a> Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).</li></ol>

Artan kanıtlar, serebrovasküler hastalık (CVD), yaşlanma ve Alzheimer hastalığının güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve demans araştırmalarının güncel bir konusu olduğunu göstermektedir 4,8,14,21. Bu nedenle, serebrovasküler ağ çalışmalarının sağlık üzerinde geniş bir etkiye sahip olacağı ve hastalık koşulları sırasında sürekli kapsamlı araştırmalar ...

Parankimal arterioller doğrudan beyin boyunca gerekli oksijen ve besinleri sağlar1. Kılcal damarlarla arayüz oluştururken, yüksek vazoaktif arterioller, spesifik nöronal bölgelerden metabolik sinyalleri algılayan kılcal iyon kanalları tarafından başlatılan retrograd sinyalizasyona yanıt verir2. Beyin parankimi tarihsel olarak araştırmanın büyük kısmını almış olmakla birlikte, endotel disfonksiyonunun rolü, demansın altında yatan çeşitli serebrovasküler bozukluklarla ilişkili patolojik mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için ortaya çıkmıştır (örneğin, iskemik inme, Alzheimer hastalığı)3,4,5,6 . Endotel, vasküler segmentler boyunca genetiğin, yapının ve fonksiyonun heterojenliği ile uyumlu olarak beynin perfüzyonunun ayrılmaz bir parçasıdır7. Pial arterler nispeten büyük boyutları, yüksek segmental vasküler dirençleri ve altta yatan serebrum 8,9'a kan akımı dağılımındaki rolleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu nedenle, arteriyolar endotel mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, yeni terapötik rejimlerin geliştirilmesine yönelik sağlık ve hastalıkta beyin kan akımı düzenlemesinin anlaşılmasını artıracaktır.
Ortaya çıkan kanıtlar, farklı sinyal yolları ve hastalıklarla ilgili olarak parankimal arteriollerin incelenmesinin önemini vurgulamaktadır 8,10. Bununla birlikte, bu yaklaşım sağlam basınçlı arteriol11 ve/veya kılcal-parankimal arteriol (CaPA) preparatları12 kullanımı ile sınırlıdır. Yeni izole edilmiş, diğer hücre tiplerinden yoksun doğal serebral arteriyolar endotel hücreleri ve kafa karıştırıcı faktörler, muhtemelen izolasyonlarındaki teknik zorluklar nedeniyle incelenmemiştir. Bu yazıda, pial arteriyel endotel13'ün izolasyonunu vurgulayan önceki bir teknik, beyin parankimal arteriollerinin endotelini güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izole etmek için ilerletmektedir (genişlik: ~25 μm, uzunluk: ~250 μm). Bu teknik, elektriksel ve kimyasal olarak bağlanmış hücrelerin bireysel yönelimlerinde ve hücresel ağlarında optimum çözünürlük elde etmelerine yardımcı olur.
İlgilenilen anahtar yollar, hücre içi Ca 2 + ([Ca2 +]i) sinyallemesinin etkileşimini ve membran potansiyelinin hiperpolarizasyonunun (Vm) 14,15 - vazodilatasyonun ayrılmazbir parçası 16 - kanın kılcal damarlara girmesine ve aktif parankim 17'ye oksijen ve besin vermesine izin vermeyi içermektedir. Bu preparatlar, Ca2 + geçirgen, geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve K + kanalları dahil olmak üzere iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarına ve / veya endotel hücre tüpleri içindeki hücre içi organellerin floresan görüntülemesine yakın fizyolojik koşullarda izin verir. Bu, beyin parankimine serebral kan akımı iletiminin endotel hücre kontrolünü yöneten fizyolojik hücresel mekanizmalarla ilgilenen araştırmacılar için uygun bir tekniktir. Toplamda, bu teknik, araştırmacıların beyin parankimine gömülü arteriollerin temel endotel sinyal yollarını ve ağ iletişimini daha iyi anlamalarına yardımcı olurken, serebrovasküler fizyoloji ve patoloji ile ilgili soruları ele alacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible baseline monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA: Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2: Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO: Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase (porcine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>E34250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence system interface, ARC lamp &#38; power supply, hyperswitch and PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Fine-tipped, sharpened)</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl: Hydrochloric Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl: Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2: Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller (digital)</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Nikon-inverted)</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8&#160;cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage (Aluminum)</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl: Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH: Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (3 mm &#38; 7 mm blades)</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Vannas style; 9.5&#160;mm &#38; 3&#160;mm blades)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller (Dual Channel)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation Table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of arteriolar endothelium of mouse brain parenchyma

Serebral kan akımı vasküler direnç arterleri ve aşağı akış parankimal arteriolleri ile iletilir. Kan akışına karşı kararlı durum vasküler direnci, arterlerden sonuçta kılcal damarlara beslenen arteriollere kadar azalan çapla artar. Parankimdeki daha küçük boyutları ve konumları nedeniyle, arterioller nispeten az çalışılmış ve bulgularda yüzey pial arterlerine göre daha az tekrarlanabilirliğe sahiptir. Ne olursa olsun, arteriyolar endotel hücre yapısı ve fonksiyonu - kronik dejeneratif hastalıkların fizyolojisi ve etiyolojisinin ayrılmaz bir parçası - kapsamlı bir araştırma gerektirir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, tehlikeye giren endotel fonksiyonunun bilişsel bozukluk ve demanstan önce geldiğini ve şiddetlendirdiğini göstermektedir.
Parankimal mikrosirkülasyonda, endotel K + kanal fonksiyonu, nöronal aktivite alanlarına kan akışındaki artışları teşvik etmek için vazodilatasyonun yayılmasını hassas bir şekilde kontrol etmek için en sağlam uyarandır. Bu yazıda, sağlam ve elektriksel olarak eşleşmiş endotel "tüplerinin" (çap, ~ 25 μm) fare beyni parankimal arteriollerinden taze izole edilmesi için rafine bir yöntem gösterilmektedir. Arteriyolar endotel tüpleri, hücre içi Ca2+ dinamikleri, membran potansiyelindeki değişiklikler ve membran lipid regülasyonu dahil olmak üzere K + kanal fonksiyonunu ve regülasyonunu kapsayan deneysel değişkenleri çözmek için fizyolojik koşullar (37 ° C, pH 7.4) sırasında sabitlenir. Arteriyel endotele karşı belirgin bir teknik avantaj, hücre ve organel (örneğin, mitokondri) boyutlarının artmış morfolojik çözünürlüğüdür ve bu da bu tekniğin kullanışlılığını arttırır. Yaşam boyunca sağlıklı serebral perfüzyon, parankimal arteriollerde sağlam endotel fonksiyonu gerektirir ve kan akışını beynin kesin anatomik bölgeleri boyunca nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlar. Bu nedenle, bu yöntemin sağlıklı ve hastalıklı beyin ile ilgili vasküler fizyoloji ve sinirbilim hakkındaki genel bilgileri önemli ölçüde ilerletmesi beklenmektedir.

Protokolün bir gösterimi Şekil 1'de arteriyoler diseksiyon ve endotel tüp izolasyon basamakları ile sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3 olarak gösterilmiştir. Burada, endotel fonksiyonu, 37 ° C'de güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti olan 2-metiltiyoadenozin difosfat (MTA), güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti] yanıtında Fura-2 fotometrisi ve keskin elektrot elektrofizyolojisi (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Bu yöntem, intraserebral kan akışını beyindeki nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlayan parankimal arteriyolar endotelin işlevi hakkında daha iyi bir fikir verecektir. Arteriol endotel üzerinde belirgin bir teknik avantaj, bireysel intraserebral endotel hücreleri ve bunların ilgili organelleri arasında morfolojik boyutların ve kalsiyum ve elektrik sinyalizasyonunun artmış çözünürlüğüdür. Başlangıçta, intraserebral endotelin izolasyonu ve muayenesi çok zor olacaktır.Bununla birlikte, bu tekniğe sabır ve özveri eşliğinde bol miktarda uygulama ile hakim olmak mümkündür. Beynin yüzeyinden kalan kanı çıkarmak için izole edilmiş beyni bir beher veya Petri kabında soğuk bir diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Parankimal arteriolleri izole etmek için ventral beyin tarafını yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir odaya yerleştirin.Parankimal arteriolleri izole etmek için, izole edilmiş beyni, 50 santimetreden daha derin odun kömürü infüzyonlu silikon polimer kaplama içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisinde çelik pimlerle sabitleyin. MCA'nın etrafındaki keskin ve hizalanmış diseksiyon makaslarıyla her iki yarımküreden bir beyin dokusu dikdörtgenini kesin, doku segmentinin üst kısmının Willis çemberinden dallanma noktasını geçmesini sağlayın. MCA çelik pimlerle yukarı bakacak şekilde beyin dokusunu kabın içine sabitleyin.Pimlerin yakınında sığ bir kesi dikkatlice yapın ve piayı küçük forsepslerle çıkarın, bir uçtan diğerine doğru hafifçe soyun. İzole edilmiş piayı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriolleri dikkatlice diseke edin. Kalan distal dalları kesin ve arteriolün doku takılmadan temiz olduğundan emin olun.Enzimatik sindirim için bu temiz bozulmamış arteriol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüpleri hazırlamak için enzimatik sindirim için her arteriol iki parçaya bölün. Arteriyolar segmentlerin kısmi sindirimi için, bozulmamış arteriyolar segmentleri papain, ditiyoeritritol, kollajenaz ve elastaz içeren 10 mililitrelik bir cam tüp içinde bir mililitre ayrışma çözeltisine yerleştirin.Arteriyolar segmentleri 10 ila 12 dakika boyunca 34 santigrat derecede inkübe edin. Arteriyolar endotel tüpünü izole etmek için, mikro şırınga enjektörüne bağlı tritürasyon pipetini odadaki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik tritürasyon için pompa kontrolöründe saniyede bir ila üç nanolitre aralığında bir hız ayarlayın.100X ila 200X büyütmeyi korurken, arteriyolar segmenti pipete çekin ve daha sonra adventiti ve düz kas hücrelerini ayırmak için enjekte edin. Tüm düz kas hücreleri ayrışana ve sadece endotel hücreleri sağlam bir tüp olarak kalana kadar damar segmentini tritüre edin. Mikro manipülatörlerle, odadaki cam kapaklar üzerindeki endotel tüpünün her bir ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri ile sabitleyin Endotel zarı potansiyelini ölçmek için, 4X hedefini incelerken, keskin elektrot ucunu arteriyolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine dikkatlice yerleştirin.Büyütmeyi kademeli olarak 400X'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. Mikro manipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak VM kaydetmeye başlayın. Endotel istirahat VM'si eksi 30 ila eksi 40 milivolt arasında stabil hale geldiğinde, deneysel amaç başına istenen farmakolojik ajanları uygulayın.Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel için floresan izleyici ile 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yükleyin. Hücreleri taze süperfüzyon fizyolojik tuz çözeltisi ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin. Endotel fonksiyonu, 37 santigrat derecede güçlü bir pürinerjik reseptör agonisti olan farmakolojik ajan MTA'ya yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve membran potansiyeli ölçülerek değerlendirildi.Bir mikromolar MTA'nın uygulanması üzerine, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu, eşlik eden bir hiperpolarizasyon ile hızla artar. Ayrıca, bozulmamış endotel, hücresel morfolojiyi incelemek için görselleştirme için floresan izleyicilerle 37 santigrat derecede inkübe edildi. Canlı endotel hücre görüntülemesinde plazma membranı ve çekirdekleri için ko-boyanma görüldü.Plazma zarı, endoplazmik retikulum floresan boyası ile birlikte boyandı ve bu sayede plazma zarının yakınında ER'nin görünür örtüşme alanları turuncu göründü. Deneyci, arteriollerin zarar görmesini önlemek için diseksiyon ve izolasyon sırasında dikkatli olmalıdır, çünkü hasarlı bir arteriol kesinlikle sağlam bir endotel tüpü vermeyecektir. İşlemi takiben, hücreler floresan antikorları ile sabit immünohistokimya veya organellerin ve membran lipitlerinin canlı hücre boyaması için kullanılabilir.Bu teknik, fizyoloji için temel düzeyde serebral kan akışının altında yatan mekanizmaları anlamak ve tedavi için patolojiye geçişleri seçmek için yeni bilgiler üretecektir.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Theta sonrası etkileri Haritalama Fonksiyonel Görüntüleme ile İnsan İşitsel korteks üzerine Stimülasyon Burst

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...